黃姍芬 馬海樂(lè) 楊 雪 王禹程 趙麗霞 李云亮

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013）

胰蛋白酶是一種動(dòng)物體內(nèi)非常重要的腸道消化酶，胰蛋白酶由223 個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量23 800，極易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，適宜pH 7.5～8.0，適宜溫度37～40 ℃，是一種絲氨酸蛋白酶。胰蛋白酶具有高度專一性，能特異性切割賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸的羧基末端形成的肽鍵。經(jīng)X-射線晶體學(xué)發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶分子由兩個(gè)大小幾乎相等的結(jié)構(gòu)域組成，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域由6 個(gè)反平行的氨基酸鏈組成，主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元為β-折疊[1]。胰蛋白酶的氨基酸序列含有6 個(gè)二硫鍵，活性位點(diǎn)氨基酸包括His 46 和Ser 183[2]。胰蛋白酶作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白水解酶，被廣泛應(yīng)用于食品、生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域[3-4]。胰蛋白酶的熱穩(wěn)定性差，使其應(yīng)用受到一定限制。

目前已有大量文獻(xiàn)通過(guò)固定化技術(shù)、化學(xué)修飾和動(dòng)態(tài)高壓微射流技術(shù)等來(lái)提高蛋白酶的熱穩(wěn)定性[5-15]。超聲波是聲源振動(dòng)頻率大于20 kHz 的機(jī)械波。超聲波由于頻率高，波長(zhǎng)短，因此其空化作用效率高，能量大，穿透力強(qiáng)。超聲波技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品、化工和生物等領(lǐng)域[16-17]。近年來(lái)，將超聲波技術(shù)應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)改性已成為新的研究熱點(diǎn)[18-21]。然而，通過(guò)超聲波技術(shù)處理蛋白酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)、中間體狀態(tài)及其結(jié)構(gòu)變化的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文主要研究超聲功率對(duì)胰蛋白酶活性、熱穩(wěn)定性、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)的影響，采用紅外光譜、熒光光譜和紫外光譜分析研究不同超聲功率處理的胰蛋白酶結(jié)構(gòu)變化與酶活性之間的關(guān)系，通過(guò)熒光相圖法發(fā)現(xiàn)和表征超聲功率誘導(dǎo)胰蛋白酶變性過(guò)程中的中間體，為擴(kuò)大胰蛋白酶工業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶，美國(guó)sigma 公司；酪蛋白，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、無(wú)水碳酸鈉、福林酚試劑等均為分析純。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

GA92-IIDB 型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，無(wú)錫上佳生物技術(shù)有限公司；Tecan Infinite PRO TWIN 200 酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；Cary Eclipse 熒光分光光度儀，美國(guó)瓦里安公司；Nicolet IS50 傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；UV-1601微量紫外分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試劑配制 胰蛋白酶緩沖溶液：1 mmol/L的HCl，內(nèi)含0.01 mol/L CaCl2。

Tris-HCl 溶液（pH 7.5）：12.114 g Tris 用蒸餾水溶解，加鹽酸調(diào)pH 7.5 后，定容至1 000 mL。

酪蛋白溶液：稱取標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白1.0000 g，用少量NaOH 溶液濕潤(rùn)后，加入80 mL Tris-HCl 溶液（pH 7.5），在沸水浴中加熱煮沸30 min，并不斷攪拌至完全溶解，冷卻至室溫，調(diào)pH 7.5 后，定容至100 mL。

胰蛋白酶溶液：稱取胃蛋白酶0.5000 g，用胰蛋白酶緩沖溶液溶解，定容至500 mL，于4 ℃冰箱放置5 h，備用。

1.3.2 酶活測(cè)定方法 參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527-2009 測(cè)定蛋白酶活力[22]，稍作修改。先將1%的酪蛋白溶液于40 ℃水浴5 min。加稀釋3.5倍的胰蛋白酶溶液0.5 mL，于40 ℃水浴2 min 后，加1%的酪蛋白溶液0.5 mL，混勻，然后在40 ℃下水浴反應(yīng)10 min，結(jié)束后加入1.0 mL 三氯乙酸?？瞻紫燃尤纫宜嵩偌永业鞍?。靜置10 min，12 000 r/min 離心5 min，取濾液30 L，碳酸鈉溶液150 μL，福林酚試劑30 L，40 ℃恒溫20 min，680 nm 下于酶標(biāo)儀測(cè)吸光值。每個(gè)樣品做3 次平行。

1.3.3 超聲波對(duì)胰蛋白酶的處理方法 量取胰蛋白酶溶液48 mL，將超聲波發(fā)生儀的探頭置于溶液中，探頭沒(méi)過(guò)溶液2 cm，不接觸溶液底部。超聲參數(shù)∶間歇比（s）為3∶3，超聲總時(shí)間5 min，超聲功率范圍（75～350 W），初始溫度控制為25 ℃。超聲預(yù)處理完畢后于4 ℃冰箱放置12 h，測(cè)其酶活、熱穩(wěn)定性、動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)、熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜。

1.3.4 超聲波對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的處理方法將未處理的胰蛋白酶溶液與超聲處理后的胰蛋白酶溶液置于水浴鍋，溫度分別為60，70，80 ℃下保溫30 min，測(cè)定胰蛋白酶溶液剩余的酶活性。

1.3.5 超聲波對(duì)胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

1.3.5.1 超聲處理方法 超聲處理胰蛋白酶溶液的方法參照1.3.3 節(jié)。

1.3.5.2 化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的計(jì)算 根據(jù)Kadkhodaee 等[23]報(bào)道的方法研究超聲處理對(duì)胰蛋白酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。在反應(yīng)過(guò)程中因?yàn)榈孜餄舛容^大，可以認(rèn)為酪蛋白反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)，其一級(jí)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型見(jiàn)下式：

由于反應(yīng)物酪蛋白減少量不易測(cè)定，因此用產(chǎn)物酪氨酸生成量的變化來(lái)反映水解過(guò)程。定溫定壓下，反應(yīng)t 時(shí)間時(shí)酪蛋白的濃度C 與潛在的酪氨酸的生成量成正比，潛在的酪氨酸的生成量為反應(yīng)完全后酪氨酸的生成量（V∞）減去已經(jīng)產(chǎn)生的酪氨酸（Vt），即C∝（V∞-Vt）。該式代入式（1）得：

式中，Vt——在時(shí)間t min 時(shí)酪氨酸的質(zhì)量濃度（μg/mL）；V∞——酪蛋白徹底水解的酪氨酸的質(zhì)量濃度（μg/mL），通過(guò)在pH 7.5、溫度40 ℃的反應(yīng)條件下酶解24 h 測(cè)得。

1.3.6 超聲波對(duì)胰蛋白酶熱力學(xué)參數(shù)的影響

1.3.6.1 胰蛋白酶的處理方法 超聲處理胰蛋白酶溶液的方法參照1.3.3 節(jié)。超聲處理后酶解溫度分別是20，25，30，35，40 ℃。

1.3.6.2 活化能、活化焓、活化熵和活化吉布斯自由能的計(jì)算 根據(jù)賈俊強(qiáng)[24]的計(jì)算方法：

做“l(fā)nkin-”圖為一條直線，由斜率可得表觀活化能Ea。

1.3.7 肽鍵紫外吸收光譜 將超聲處理好的胰蛋白酶溶液在25 ℃環(huán)境溫度下，胰蛋白酶質(zhì)量濃度1 mg/mL，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定為220 nm 波長(zhǎng)紫外吸收值，以胰蛋白酶緩沖溶液作為空白光譜。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜 將超聲處理好的胰蛋白酶溶液在25 ℃環(huán)境溫度下，胰蛋白酶質(zhì)量濃度1 mg/mL，采用傅里葉變換紅外光譜儀在波數(shù)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，掃描條件：加樣量0.10 mL，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32 次。以空氣的光譜為背景。經(jīng)儀器自帶的Omnic 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后，采用Peakfit 對(duì)酰胺Ⅰ帶 （1 700～1 600 cm-1）進(jìn)行解卷積和分峰、擬合，并對(duì)各子峰歸屬進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)指認(rèn)。

1.3.9 熒光相圖法表征超聲波誘導(dǎo)的中間體結(jié)構(gòu)

熒光相圖法的原理是不同試驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化（去折疊/折疊），將發(fā)射波長(zhǎng)分別為λ1和λ2時(shí)所測(cè)得的相應(yīng)熒光強(qiáng)度I（λ1）對(duì)I（λ2）作圖（稱為熒光相圖），由于熒光強(qiáng)度是一種與蛋白質(zhì)的量成正比且具有加和性的廣度性質(zhì)，因此這兩個(gè)變量間存在下列3 個(gè)關(guān)系式[25-26]：

在蛋白質(zhì)折疊與去折疊的過(guò)程中，如果整個(gè)過(guò)程中蛋白質(zhì)只存在完全折疊和完全去折疊結(jié)構(gòu)，即“全或者無(wú)”，那么I（λ1）=a+bI（λ2），即I（λ1）與I（λ2）線性相關(guān)。如果整個(gè)結(jié)構(gòu)變化過(guò)程中存在1 個(gè)或1 個(gè)以上的中間體，I（λ1）與I（λ2）是非線性相關(guān)的，且每1 條直線代表1個(gè)“全或者無(wú)”的結(jié)構(gòu)變化。

圖1 超聲功率對(duì)胰蛋白酶活性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on trypsin activity

超聲處理之后的胰蛋白酶溶液稀釋7 倍，用Cary Eclipse 熒光分光光度儀的激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫10 nm，掃描范圍300～400 nm，掃描速度1 200 nm/min。讀取熒光發(fā)射光譜320 nm 和364 nm 的熒光強(qiáng)度I320和I364，然后以I320為橫坐標(biāo)，I364為縱坐標(biāo)，用origin 作圖，對(duì)散點(diǎn)進(jìn)行線性擬合。λ1和λ2一般分別取320 和365[25-26]，由于儀器限制，λ2取364。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對(duì)胰蛋白酶活性的影響

胰蛋白酶活性隨超聲功率的變化曲線如圖1所示。胰蛋白酶活性隨著超聲功率的增加出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象。除了300 W 和350 W 時(shí)，其余超聲功率對(duì)胰蛋白酶活性提高都有顯著差異。其中在250 W 時(shí)，胰蛋白酶活性最高，依次是125 W 和175 W。酶活性比未超聲處理的酶活性依次提高26.9%，25.3%和22.2%。

2.2 超聲功率對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

將經(jīng)超聲處理后的胰蛋白酶溶液在60，70，80 ℃中恒溫保持30 min，再測(cè)定其酶活。由圖2可知，超聲后胰蛋白酶在60 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性，除了300 W，其余的超聲功率處理后酶活殘留率都比對(duì)照有明顯降低（P＜0.05）。由圖3可知，除了300 W和350 W，超聲后的胰蛋白酶在70 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，其余的超聲功率處理后酶活殘留率都比對(duì)照組低（P＜0.05）。由圖4可知，超聲后的胰蛋白酶在80 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性，300 W 和350 W 超聲處理后的酶活分別提高了5.64%和19.19%（P＜0.01）。說(shuō)明大超聲功率對(duì)胰蛋白酶在70，80 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性促進(jìn)作用更好。

圖2 超聲功率對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性（60 ℃）的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （60 ℃）

圖3 超聲功率對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性（70 ℃）的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （70 ℃）

2.3 超聲功率對(duì)胰蛋白酶酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

反應(yīng)速率常數(shù)是化學(xué)動(dòng)力學(xué)中一個(gè)重要的物理量，其數(shù)值直接反應(yīng)了速率的快慢，反應(yīng)速率常數(shù)越大，反應(yīng)速率越快。速率常數(shù)與反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)和催化劑等有關(guān)。由圖5可知，反應(yīng)速率常數(shù)kin隨著酶解溫度的增加而逐漸上升。胰蛋白酶在20，30，40 ℃酶解時(shí)，75 W 超聲處理后的反應(yīng)速率常數(shù)分別比對(duì)照提高了13.50%，11.91%和8.02%。然而，胰蛋白酶在35 ℃酶解時(shí)，所有超聲處理后的反應(yīng)速率常數(shù)都與對(duì)照組相比無(wú)顯著提高。整體來(lái)看，胰蛋白酶在低溫條件下酶解時(shí)，75 W 超聲處理對(duì)反應(yīng)速率常數(shù)的促進(jìn)作用最顯著，反應(yīng)速率最快。

2.4 超聲功率對(duì)胰蛋白酶酶促反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)的影響

Ea 是基態(tài)反應(yīng)物分子與過(guò)渡態(tài)之間的能量差，其決定反應(yīng)速度。由表1可知，胰蛋白酶經(jīng)不同超聲功率處理后，125，150，200 W 時(shí)，Ea 都比對(duì)照低，200 W 時(shí)的Ea 最低，反應(yīng)速度最快，比對(duì)照降低了21.32%。ΔH 是由一種狀態(tài)變?yōu)榱硪环N狀態(tài)的過(guò)程中所吸收的熱量。胰蛋白酶經(jīng)不同超聲功率處理后，100，125，150，200 W 時(shí)的ΔH 都比對(duì)照小，說(shuō)明其反應(yīng)所吸收的熱量比對(duì)照少。其中150 W 和200 W 時(shí)的ΔH 比對(duì)照有極顯著差異（P＜0.01），分別比對(duì)照降低了16.49%和15.05%。ΔS 是負(fù)值，表明活化絡(luò)合物形成過(guò)程是有序性增加的過(guò)程。胰蛋白酶經(jīng)不同超聲功率處理后，100，125，150，200 W 時(shí)的ΔS 都比對(duì)照小，說(shuō)明此狀態(tài)的胰蛋白酶有序性比對(duì)照高。其中150 W 和200 W 時(shí)的ΔS 比對(duì)照有極顯著差異（P＜0.01），分別比對(duì)照降低了12.94%和12.08%。ΔG 表示反應(yīng)容易程度。75～250 W 時(shí)的ΔG 與對(duì)照無(wú)顯著差異。300 W 和350 W 時(shí)的ΔG 比對(duì)照大，反應(yīng)比對(duì)照更難進(jìn)行。

圖4 超聲功率對(duì)胰蛋白酶熱穩(wěn)定性（80 ℃）的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （80 ℃）

2.5 超聲功率對(duì)胰蛋白酶結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 超聲功率對(duì)胰蛋白酶220 nm 紫外吸收光譜的影響 肽鍵的主要吸收峰在200～240 nm[27]，一般選取220 nm 的紫外吸收反映肽鍵含量的變化。超聲功率對(duì)胰蛋白酶在220 nm 的紫外吸收光譜的影響如圖6所示。

不同超聲功率處理胰蛋白酶后，其在220 nm的紫外吸收值與未超聲處理時(shí)相比，沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明胰蛋白酶肽鍵的含量并沒(méi)有明顯變化。

2.5.2 超聲功率對(duì)胰蛋白酶傅立葉變換紅外光譜的影響 傅里葉變換紅外光譜反應(yīng)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，不受樣品所處物理狀態(tài)的影響。傅里葉變換紅外光譜是分子振動(dòng)光譜，主要分析酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）的C＝O 伸縮振動(dòng)而吸收的紅外光。查閱文獻(xiàn)，根據(jù)“分子指紋”對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行指認(rèn)以及分析計(jì)算[28-30]。β-折疊（1 610～1 640 cm-1，1 670～1 690 cm-1），α-螺 旋（1650～1 660 cm-1），無(wú)規(guī)則卷曲（1 640～1 650 cm-1），β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 670 cm-1，1 690～1 700 cm-1）。超聲功率對(duì)胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如表2所示。

從表2可以得出，超聲功率對(duì)胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著影響。75，100，125，150，175 W 超聲處理使胰蛋白酶的α-螺旋顯著增加，與此同時(shí)β-折疊顯著減少，無(wú)規(guī)則卷曲明顯減少。然而，200，250，300，350 W 超聲處理與未超聲處理的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的含量沒(méi)有明顯差異。

圖5 超聲功率對(duì)胰蛋白酶反應(yīng)速率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on trypsin reaction rate

圖6 超聲功率對(duì)胰蛋白酶的220 nm 紫外吸收的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on ultraviolet absorption of trypsin at 220 nm

表1 超聲功率對(duì)胰蛋白酶熱力學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effect of ultrasonic power on thermodynamic parameters of trypsin

表2 超聲功率對(duì)胰蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Table 2 Ultrasonic power on the secondary structure of trypsin content

2.6 超聲功率誘導(dǎo)胰蛋白酶產(chǎn)生中間體結(jié)構(gòu)

由圖7可知，經(jīng)超聲功率誘導(dǎo)胰蛋白酶去折疊的熒光相圖由2 條直線組成，交點(diǎn)出現(xiàn)在200 W。說(shuō)明超聲功率誘導(dǎo)的胰蛋白酶變性過(guò)程中存在1 個(gè)部分折疊的中間體，且這個(gè)中間體出現(xiàn)在在超聲功率為200 W 時(shí)。

圖7 超聲功率誘導(dǎo)的胰蛋白酶去折疊的熒光相圖Fig.7 Trypsin unfolding fluorescence phase diagram induced by ultrasonic power

3 結(jié)論

通過(guò)以上試驗(yàn)結(jié)果得出，超聲波功率對(duì)胰蛋白酶活性的影響雖然出現(xiàn)波動(dòng)現(xiàn)象，但整體來(lái)說(shuō)，胰蛋白酶的活性隨著超聲功率的增加，先上升后下降。除300，350 W 之外，胰蛋白酶酶活性與對(duì)照相比有顯著提高。在熱穩(wěn)定分析中，80 ℃處理后，在300，350 W 時(shí)的胰蛋白酶熱穩(wěn)定性顯著提高，分別比對(duì)照提高了5.64%和19.19%。說(shuō)明較大的超聲功率對(duì)高溫處理的胰蛋白酶熱穩(wěn)定性的促進(jìn)作用更好。250，300 W 時(shí)，胰蛋白酶活性低而熱穩(wěn)定性高。其余超聲功率胰蛋白酶活性高而熱穩(wěn)定性低。

在超聲波對(duì)胰蛋白酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)分析中，20 ℃酶解時(shí)75 W 對(duì)反應(yīng)速率常數(shù)的促進(jìn)作用最顯著，比對(duì)照提高了13.50%。說(shuō)明低溫酶解時(shí)，低的超聲強(qiáng)度對(duì)反應(yīng)速率常數(shù)的促進(jìn)作用更好。200 W 處理時(shí)胰蛋白酶的Ea 最小，即反應(yīng)速率最快，比對(duì)照降低了21.32%。150，200 W 處理時(shí)胰蛋白酶的ΔH 和ΔS 與對(duì)照相比有顯著差異，比對(duì)照分別降低了16.49%，15.05%，12.94%，12.08%。說(shuō)明反應(yīng)所吸收的熱量少，胰蛋白酶的有序性高。75～250 W 處理時(shí)胰蛋白酶的ΔG 與對(duì)照無(wú)顯著差異，即反應(yīng)容易程度無(wú)明顯改善。紫外光譜表明，超聲波沒(méi)有明顯改變胰蛋白酶的肽鍵含量。紅外光譜表明，超聲波顯著改變了胰蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。熒光光譜發(fā)現(xiàn)超聲波能誘導(dǎo)胰蛋白酶產(chǎn)生中間體，且中間體出現(xiàn)在200 W。中間體狀態(tài)的胰蛋白酶的有序性高，同時(shí)具有高酶活和高反應(yīng)速率。