孫婷婷 李妍妍 周 君 張迪駿 黃忠白 何 珊 李 曄 張春丹 蘇秀榕*

（1 寧波大學海洋學院 浙江寧波315211 2 齊魯師范學院生命科學學院 山東濟南250000）

仿刺參（Apostichopus joponicus），屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuriodea）、盾手目動物（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus）[1]。主要分布于我國山東、遼寧和河北沿海，主產于威海、煙臺、大連、長島等地。自古以來，我國居民認為海參不僅是一種佳肴，還是一種滋補佳品，可治療或輔助治療某些疾病。向怡卉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參中含有多種營養(yǎng)成分，19 種氨基酸和多種維生素以及豐富的礦物質；蘇秀榕[3-4]、張悅容[5]、侯付景[6]等研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參中含有多種不飽和脂肪酸，為仿刺參的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。

黃嘌呤氧化酶既能催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進而生成尿酸，又能直接催化黃嘌呤生成尿酸。尿酸是人類嘌呤代謝的終產物，人體的尿酸由體內合成和核酸分解代謝兩條途徑產生。近年來，隨著人們生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高，有研究對居住成都在3年以上的7 288例人群進行調查，結果顯示：高尿酸血癥患病率男性為19.8%，女性為5.1%[7]。高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂，使尿酸生成增多和（或）排泄減少所致的代謝性疾病，其患者不僅會繼發(fā)成為痛風，造成關節(jié)疼痛，而且會成為心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、腎等疾病的危害因素[8]。

目前，治療高尿酸血癥的藥物非常有限，主要依賴抑制尿酸合成（XO 抑制劑）和促進尿酸排泄（丙磺舒）兩類藥物[9]，這類藥物往往會造成過敏皮疹、白細胞及血小板減少、肝功能損害等不良副作用[10]。國內除了加味茵陳五苓散[11]、樺褐孔菌提取物[12]等少數(shù)研究外，未見其它報道。尋找新型、天然、無害的降尿酸保健品成為抗高尿酸血癥研究的熱點。

海參除具有較廣的抗腫瘤及抗凝血的作用[3]外，還具有鎮(zhèn)痛解痙，抗疲勞，防治動脈粥樣硬化[13]和增強機體免疫功能的作用[14]。仿刺參預防高尿酸血癥的研究，國內外未見報道。本文以SD 大鼠為研究對象，探討仿刺參抑制黃嘌呤氧化酶的活性以及抗高尿酸血癥的效果。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

鹽漬仿刺參，體質量（35±5）g，寧波奉化博望水產養(yǎng)殖公司；SD 大鼠，（220±10）g，浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心。

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶，上海生物制劑廠；尿酸（UA）、血尿素氮（BUN）試劑盒；寧波美康生物技術有限公司；黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器及設備

7020 全自動生化分析儀，日本日立儀器公司；LuxScanTM10K-A 雙通道激光共聚焦掃描儀，北京博奧生物有限公司；S2-81 型不銹鋼小型攪拌機，中國九陽股份有限公司；5418R 型離心機，德 國Eppendorf 公 司；NanoDrop 2000C，美 國Thermo Fisher 公司。

1.3 酶解條件的優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗 將仿刺參水煮3 次去除體內的NaCl 加適量純凈水絞碎，分別添加木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶，在各自適宜條件下，進行水解試驗，根據(jù)水解度篩選酶。以水解度（DH）為指標，選取時間、溫度和加酶量進行單因素試驗。

1.3.2 響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗確定各因素最佳條件后，以Box-Benhnken 中心組合原理，設計3 因素3 水平試驗優(yōu)化仿刺參水解條件。

1.3.3 酶解液的制備 選取復合蛋白酶，55 ℃條件下酶解仿刺參136 min，并在100 ℃水浴中滅酶10 min，冷凍，待用。

1.4 動物實驗

1.4.1 動物飼養(yǎng)和給藥 SD 大鼠60 只，雌雄各半，分為空白組（N）、模型組（M）、仿刺參酶解液高劑量組（G1：10 mL/kg·d）、低劑量組（G2：6 mL/kg·d）。除空白組外，其余各組大鼠按每日3 mg/kg·d的劑量灌胃酵母膏淀粉混合液[15]，并喂以200 mg/kg·d 氧嗪酸鉀，造模，空白和模型對照組按低劑量灌等量蒸餾水。試驗期間，各組自由進食、進水，室溫保持25 ℃左右，光照晝夜間隔12 h，給藥時間28 d。

1.4.2 生化指標檢測 各組大鼠腹主動脈取血，3 000 r/min 離心，取上層血清，采用全自動生化分析儀測定血清中尿酸和尿素氮的含量及黃嘌呤氧化酶的活性。

1.5 基因芯片的檢測

1.5.1 RNA 的提取和測定 取大鼠肝100 mg，液氮研磨后用Trizol 一步法提取總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進一步采用Nucleo SpinRRNA clean-up 試劑盒對總RNA 進行過柱純化，用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢。

1.5.2 cRNA 合成 每5 個大鼠為一組進行總RNA 等量混合，純化后取2 μg 的mRNA 為模板，使用反轉錄酶合成第一條cDNA，并加外標，用RNase H 將雜合鏈中的RNA 切成短片段，用DNA 聚合酶以RNA 短片段為引物延伸，合成第二條cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA 為模板，利用T7 試劑盒合成cRNA；然后用RNA 試劑盒純化。取2 μg cRNA，隨機引物進行反轉錄，其產物用試劑盒純化。取上述反轉錄產物，以隨機引物、Cy5-dCTP 和Cy3-dCTP，Klenow 酶進行PCR擴增，標記產物再純化、抽干。

1.5.3 雜交與清洗 標記的DNA 溶于80 μL 雜交液中 （3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart's，25%甲酰胺），于42 ℃雜交過夜。雜交結束后，先在42 ℃含0.2%SDS，2×SSC 的液體中洗5 min，而后在0.2×SSC 中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

1.5.4 掃描和數(shù)據(jù)分析 用雙通道激光共聚焦掃描儀進行掃描。在芯片上每個基因重復3 次，熒光交換后每個基因重復6 次，用LuxScan3.0 軟件進行數(shù)據(jù)的提取，用t 檢驗的方法來挑選差異基因。對每個掃描信號的Lowess 歸一化的Ratio 值進行統(tǒng)計，刪除了熒光信號弱的基因（保留了信號值≥800 的表達基因和400～800 的臨界表達基因的信號值）以及芯片上的陰性對照、內標、外標等冗余的數(shù)據(jù)，從剩下的基因中挑選至少有4 次Ratio 值的基因進行t 檢驗。計算得到的t 值如果大于0.05，則表明該基因在95%的水準上為差異表達。最后挑選差異表達基因，即用SAM 軟件進行分析，F(xiàn)DR 控制在5%以內，再以1.5 倍標準篩選差異表達基因進行片間校正和片內歸一化，及信號可信度P 值分析、GO Terms 和Pathway Miner 分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 進行方差分析。

1.6 熒光定量PCR 驗證差異基因

1.6.1 模板的制備 按步驟1.5.1 節(jié)和1.5.2 節(jié)得到cDNA。

1.6.2 引物設計 根據(jù)基因序列，利用Primer3.0進行RT-qPCR 引物設計，具體引物信息見表1。

表1 RT-qPCR 引物信息Table 1 Primers used in the RT-qPCR

1.6.3 標準曲線的構建 將合成的cDNA 模版稀釋成10-3，10-4，10-5和10-64 個濃度梯度作為模板進行RT-qPCR 反應。反應體系總體積為20 μL，其中包括：0.8 μL 上游引物（10 μmol/L）、0.8 μL 下游 引 物 （10 μmol/L）、2 μL 模 板cDNA、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM III，并用ddH2O 補足20 μL 體系。反應程序為95 ℃預變性10 s；95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s，共35 個循環(huán)。

1.6.4 RT-qPCR 經(jīng)過標準曲線驗證，確定合適的RT-qPCR 反應體系和程序，對cDNA 分別進行目的基因和內參基因的擴增。利用標準曲線算出Ct 值，并利用Comparative Delta-delta Ct 法進行相對定量分析。

2 結果與分析

2.1 單因素酶解試驗

在相同溫度和pH 值下分別加入2%的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶，酶解時間2.5 h。復合蛋白酶的水解度為78%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度分別為68%和60%，因此確定復合蛋白酶為水解酶。

從圖1可以看出，隨著時間的延長，水解度先緩慢升高后下降。當水解時間為150 min 時，水解度最大；當水解時間繼續(xù)延長時，酶解率下降（圖1a）。當溫度達到55 ℃時，水解度最大；當溫度大于55 ℃時，水解度又下降（圖1b）。當加酶量大于2%時，酶解率逐漸上升（圖1c）。

2.2 響應面法優(yōu)化酶解工藝

2.2.1 因素選取及分析 選用復合蛋白酶進行仿刺參水解的單因素分析，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設計原理，以水解度為響應值，選取水解溫度、水解時間和加酶量進行響應面試驗。試驗次數(shù)為15，其中析因部分試驗次數(shù)為12，中心點重復試驗次數(shù)為3（表2）。

采用響應面法分析試驗結果，得到水解度為響應值的回歸方程：仿刺參的水解度=80.18+5.54A+2.83B+10.09C-5.91AB+0.94AC-0.13BC-9.99A2-7.85B2-11.09C2。

利用Design Expert 軟件對表2的試驗結果進行二次多元回歸擬合，并進行方差分析，水解度回歸方程的顯著性檢驗P<0.05，說明水解度試驗中回歸模型的預測值均與實際值吻合，模型顯著；模型失擬項的P=0.2037（P>0.05），說明未知因素對試驗結果干擾很小，即該方程與實際數(shù)據(jù)之間的擬合性好。另外，由統(tǒng)計學計算得出，模型的R2為0.9061。綜上所述，該試驗方法可靠，可以用該模型分析和預測試驗數(shù)據(jù)（表3）。

圖1 各因素對仿刺參水解度的影響Fig.1 The effects of various factors on the DH of of Apostichopus joponicus

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established native regression model

2.2.2 響應面交互作用及優(yōu)化 通過響應面三維圖可對任何兩因素的交互影響及各因素對響應值的影響進行分析和評價[16-17]，并從中確定最佳因素水平范圍[18]。圖2a～2c 分別表示了溫度和時間、溫度和加酶量、時間和加酶量3 組因素對水解度的影響。響應面三維圖像的坡度大小反映響應值對該因素的敏感程度[19]。本試驗響應面坡度陡峭，表明水解度受各因素影響大。

通過軟件分析、計算，得到一組最優(yōu)條件，對應的編碼值分別為A：0.28；B：0.07；C：0.47，與之對應的最佳工藝條件：酶解溫度55 ℃，酶解時間136 min，加酶量1.97%。在此條件下，響應面預測的水解度最大值為83.29%。用上述優(yōu)化條件進行試驗，得到的水解度與理論值基本相符（圖2）。

圖2 各因素相互作用對水解度的影響Fig.2 The effect of the interaction of various factors on the degree of hydrolysis

2.3 血清生化指標

與空白對照組相比，模型組大鼠血清中的UA、XOD 和BUN 水平明顯增高，分別達到96.79 μmol/L、14.59 U/L 和5.89 mmol/L，且差異顯著（P＜0.05）。仿刺參酶解液組大鼠喂藥后，血清中的UA和BUN 水平明顯下降，分別為67.16 μmol/L 和5.14 mmol/L；XOD 的活性也最小，為13.76 U/L（表4）。

表4 大鼠的血清UA，XOD 和BUN 水平（±s）Table 4 The serum UA，XOD and BUN levels of the rats （±s）

表4 大鼠的血清UA，XOD 和BUN 水平（±s）Table 4 The serum UA，XOD and BUN levels of the rats （±s）

注：a.P＜0.05；aa.P＜0.01。

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2.4 基因表達的差異

2.4.1 微陣列芯片分析結果 利用非監(jiān)督聚類的等階聚類方法（Hierarchical clustering）比較分析后，利用基因分布的火山圖展示基因表達差異性。上調基因少于下調基因（圖3）。

利用SAM 進行分析，模型組和酶解液組分別聚為一類，兩者區(qū)分度高；在相同類別中，同一基因的表達情況基本相同，而不同類別間，同一基因的表達情況差異很大。芯片結果顯示，酶解液組和模型組比較，獲得差異基因179 個，其中36 個上調，143 個下調（圖4）。

圖3 大鼠基因分布的火山圖Fig.3 Volcano plots of gene distribution of rats

圖4 差異基因聚類分析Fig.4 Cluster analysis of differential gene

2.4.2 差異基因的GO 分析 酶解液組與模型組的差異基因本體聯(lián)合分析（Gene ontology，GO），在生物學過程分析大鼠差異表達基因發(fā)現(xiàn)，與調控相關的基因58.8%，與新陳代謝相關的基因14.7%。從細胞組分分析大鼠差異表達基因，與細胞成分相關的基因19.6%，細胞外基質為17.6%，蛋白質等其它大分子復合物為13.7%。從分子功能過程分析，具有結合功能的基因88.0%，具有催化活性的基因12.0%。痛風與許多基因表達之間存在廣泛作用，而這些基因中含有某些關鍵代謝酶密碼，往往可以控制新陳代謝途徑中關鍵酶的表達，從而對整個新陳代謝產生影響。食用仿刺參酶解液后，大鼠與結合功能相關的基因變化非常明顯，與調控相關的基因次之。

2.5 RT-qPCR 結果

本方法在稀釋為原濃度10-2，10-3，10-4和10-5模版濃度范圍內取得了較好的線性關系。對通過基因芯片篩選的部分差異基因的RT-qPCR，分析顯示與基因芯片結果一致。如基因Krt14 的相對表達量，在基因芯片結果中酶解液組上調1.33倍，在定量PCR 結果中酶解液組上調1.25 倍。如基因SPP1 的相對表達量，在基因芯片結果中酶解液組下調1.3 倍，在定量PCR 結果中酶解液組下調1.5 倍。從圖中可以看出Krt14、Vim、Nime2、Spp1、Oash1h、Adora2a、Cck 這7 個基因，定量PCR結果和基因芯片結果一致；基因Mthfd1 和Gprotein，定量PCR 結果和基因芯片結果不一致；Flt1、Syp、Adss 這3 個基因，定量PCR 結果模型組和酶解液組沒有差異，基因芯片結果酶解液組表達量下調（圖5）。

圖5 RT-qPCR 結果Fig.5 The result of RT-qPCR

3 討論

目前，水產動物蛋白質水解，多用復合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，或者采用兩種或幾種蛋白酶的復合物。向怡卉等[20]對海參生殖腺水解的研究采用的是復合蛋白酶。實際生產中，酶的選擇應綜合水解效果、成本等因素。本文比較了復合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在仿刺參水解過程中的作用效果，發(fā)現(xiàn)復合蛋白酶水解效果最好，最佳條件加酶量為1.97%，水解時間136 min，水解溫度55 ℃。

黃嘌呤氧化酶（XOD）在尿酸生成過程中發(fā)揮著重要作用，直接調控著體內尿酸水平的高低[21]?？讗偟萚22]研究表明，在高尿酸血癥時，XOD 活性會發(fā)生相應變化。不少專家學者對9-苯基鳥嘌呤[23]、羥基胡椒酚等的相關抑制XOD 的作用進行研究，發(fā)現(xiàn)抑制XOD 活性是降低尿酸、預防痛風的關鍵[24-25]。

仿刺參的脂肪含量低，蛋白質含量高，富含人體所需的多種氨基酸。本研究表明，喂食仿刺參后大鼠體內的血尿酸含量明顯降低，這說明仿刺參有抑制XOD 活性，改善高尿酸血癥的功效。同時，通過對黃嘌呤氧化酶的檢測，發(fā)現(xiàn)喂食仿刺參后，大鼠體內的XOD 活性明顯降低，可以推測，仿刺參的作用機理主要是以黃嘌呤氧化酶為靶點，通過抑制其活性從而減少尿酸的合成，緩解高尿酸血癥及其并發(fā)癥的影響。

實踐證明生物體內代謝酶的活性和濃度會因為不同的營養(yǎng)條件而存在較大差異，這主要是由于食物中的營養(yǎng)物質影響了基因的表達。當某種營養(yǎng)素缺失或過多時，在分子水平上表現(xiàn)為某個或某些基因的開放、關閉或表達量的變化，雖然動物的遺傳特征不會因為營養(yǎng)素而改變，但它可以通過啟動或終止一些基因的表達而改變遺傳特征出現(xiàn)的時間框架。

喂食仿刺參后的大鼠基因表達出現(xiàn)明顯的差異，下調基因數(shù)量明顯多于上調基因的數(shù)量，差異基因包括能量代謝相關、糖代謝、細胞生長、合成及分解代謝、信號傳遞因子等。有一半的差異基因與疾病有關。

其中，酪氨酸（Ywhah2）可以使大鼠體內寡腺嘌吟核苷酸減少，從而減少體內尿酸的生成。分裂周期蛋白（Adora2a）可以和其它物質結合生成異源二聚體復合物，參與磷酸化多種蛋白，調節(jié)DNA 復制。細胞凋亡（Cck）存在生物過程的各個階段。分泌性糖蛋白（Spp1）可以促進細胞的粘附和遷移，研究顯示Spp1 與疾病的嚴重程度有重大關系。食用酶解液的大鼠中這4 個基因均表達下調。2′-5′寡腺苷酸合成酶（Osa）在細胞膜受體等作用下，可以形成2-5 寡糖苷酸（2-5A），2-5A 特異性結合核酸內切酶降解病毒的mRNA。食用酶解液的大鼠Osa 表達上調。路徑分析中可以看出，高尿酸血癥與肥胖、糖代謝、腫瘤有關，這與張長青等[26]、韓睿等[27]的研究結果一致。另有研究表明，痛風或可降低阿爾茨海默病的發(fā)病率，在大鼠基因芯片路徑分析中可以看出糖代謝和阿爾茨海默病相關基因差異明顯。

結合前期差異基因結果和RT-qPCR 結果，對仿刺參酶解液抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用機制進行歸納。果糖1，6-二磷酸醛縮酶（Aldoa）是糖異生途徑中的關鍵酶催化1，6-二磷酸果糖生成6磷酸果糖。大鼠進食蛋白含量很高的仿刺參酶解液之后，肝中糖原增加，糖的異生作用增強，因而氨基酸成糖成為氨基酸代謝的主要途徑。由基因芯片結果可以看出，果糖1，6-二磷酸醛縮酶基因上調明顯，故糖異生作用增強，氨基酸代謝主要通過糖異生轉化為糖，通過其它代謝途徑生成嘌呤、嘧啶的量減少。減少了大鼠體內嘌呤的生成，緩解高尿酸血癥。