孫婷婷 李妍妍 周 君 張迪駿 黃忠白 何 珊 李 曄 張春丹 蘇秀榕*

（1 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波315211 2 齊魯師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 山東濟(jì)南250000）

仿刺參（Apostichopus joponicus），屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothuriodea）、盾手目動物（Aspidochirota）、刺參科（Stichopodidae）、仿刺參屬（Apostichopus）[1]。主要分布于我國山東、遼寧和河北沿海，主產(chǎn)于威海、煙臺、大連、長島等地。自古以來，我國居民認(rèn)為海參不僅是一種佳肴，還是一種滋補(bǔ)佳品，可治療或輔助治療某些疾病。向怡卉等[2]研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參中含有多種營養(yǎng)成分，19 種氨基酸和多種維生素以及豐富的礦物質(zhì)；蘇秀榕[3-4]、張悅?cè)輀5]、侯付景[6]等研究發(fā)現(xiàn)，仿刺參中含有多種不飽和脂肪酸，為仿刺參的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

黃嘌呤氧化酶既能催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進(jìn)而生成尿酸，又能直接催化黃嘌呤生成尿酸。尿酸是人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，人體的尿酸由體內(nèi)合成和核酸分解代謝兩條途徑產(chǎn)生。近年來，隨著人們生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高，有研究對居住成都在3年以上的7 288例人群進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示：高尿酸血癥患病率男性為19.8%，女性為5.1%[7]。高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂，使尿酸生成增多和（或）排泄減少所致的代謝性疾病，其患者不僅會繼發(fā)成為痛風(fēng)，造成關(guān)節(jié)疼痛，而且會成為心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、腎等疾病的危害因素[8]。

目前，治療高尿酸血癥的藥物非常有限，主要依賴抑制尿酸合成（XO 抑制劑）和促進(jìn)尿酸排泄（丙磺舒）兩類藥物[9]，這類藥物往往會造成過敏皮疹、白細(xì)胞及血小板減少、肝功能損害等不良副作用[10]。國內(nèi)除了加味茵陳五苓散[11]、樺褐孔菌提取物[12]等少數(shù)研究外，未見其它報(bào)道。尋找新型、天然、無害的降尿酸保健品成為抗高尿酸血癥研究的熱點(diǎn)。

海參除具有較廣的抗腫瘤及抗凝血的作用[3]外，還具有鎮(zhèn)痛解痙，抗疲勞，防治動脈粥樣硬化[13]和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[14]。仿刺參預(yù)防高尿酸血癥的研究，國內(nèi)外未見報(bào)道。本文以SD 大鼠為研究對象，探討仿刺參抑制黃嘌呤氧化酶的活性以及抗高尿酸血癥的效果。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

鹽漬仿刺參，體質(zhì)量（35±5）g，寧波奉化博望水產(chǎn)養(yǎng)殖公司；SD 大鼠，（220±10）g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，上海生物制劑廠；尿酸（UA）、血尿素氮（BUN）試劑盒；寧波美康生物技術(shù)有限公司；黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器及設(shè)備

7020 全自動生化分析儀，日本日立儀器公司；LuxScanTM10K-A 雙通道激光共聚焦掃描儀，北京博奧生物有限公司；S2-81 型不銹鋼小型攪拌機(jī)，中國九陽股份有限公司；5418R 型離心機(jī)，德 國Eppendorf 公 司；NanoDrop 2000C，美 國Thermo Fisher 公司。

1.3 酶解條件的優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗(yàn) 將仿刺參水煮3 次去除體內(nèi)的NaCl 加適量純凈水絞碎，分別添加木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在各自適宜條件下，進(jìn)行水解試驗(yàn)，根據(jù)水解度篩選酶。以水解度（DH）為指標(biāo)，選取時(shí)間、溫度和加酶量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素最佳條件后，以Box-Benhnken 中心組合原理，設(shè)計(jì)3 因素3 水平試驗(yàn)優(yōu)化仿刺參水解條件。

1.3.3 酶解液的制備 選取復(fù)合蛋白酶，55 ℃條件下酶解仿刺參136 min，并在100 ℃水浴中滅酶10 min，冷凍，待用。

1.4 動物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動物飼養(yǎng)和給藥 SD 大鼠60 只，雌雄各半，分為空白組（N）、模型組（M）、仿刺參酶解液高劑量組（G1：10 mL/kg·d）、低劑量組（G2：6 mL/kg·d）。除空白組外，其余各組大鼠按每日3 mg/kg·d的劑量灌胃酵母膏淀粉混合液[15]，并喂以200 mg/kg·d 氧嗪酸鉀，造模，空白和模型對照組按低劑量灌等量蒸餾水。試驗(yàn)期間，各組自由進(jìn)食、進(jìn)水，室溫保持25 ℃左右，光照晝夜間隔12 h，給藥時(shí)間28 d。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測 各組大鼠腹主動脈取血，3 000 r/min 離心，取上層血清，采用全自動生化分析儀測定血清中尿酸和尿素氮的含量及黃嘌呤氧化酶的活性。

1.5 基因芯片的檢測

1.5.1 RNA 的提取和測定 取大鼠肝100 mg，液氮研磨后用Trizol 一步法提取總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進(jìn)一步采用Nucleo SpinRRNA clean-up 試劑盒對總RNA 進(jìn)行過柱純化，用分光光度計(jì)定量，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。

1.5.2 cRNA 合成 每5 個大鼠為一組進(jìn)行總RNA 等量混合，純化后取2 μg 的mRNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA，并加外標(biāo)，用RNase H 將雜合鏈中的RNA 切成短片段，用DNA 聚合酶以RNA 短片段為引物延伸，合成第二條cDNA，并純化雙鏈cDNA。以cDNA 為模板，利用T7 試劑盒合成cRNA；然后用RNA 試劑盒純化。取2 μg cRNA，隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物用試劑盒純化。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以隨機(jī)引物、Cy5-dCTP 和Cy3-dCTP，Klenow 酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，標(biāo)記產(chǎn)物再純化、抽干。

1.5.3 雜交與清洗 標(biāo)記的DNA 溶于80 μL 雜交液中 （3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart's，25%甲酰胺），于42 ℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42 ℃含0.2%SDS，2×SSC 的液體中洗5 min，而后在0.2×SSC 中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。

1.5.4 掃描和數(shù)據(jù)分析 用雙通道激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描。在芯片上每個基因重復(fù)3 次，熒光交換后每個基因重復(fù)6 次，用LuxScan3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取，用t 檢驗(yàn)的方法來挑選差異基因。對每個掃描信號的Lowess 歸一化的Ratio 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，刪除了熒光信號弱的基因（保留了信號值≥800 的表達(dá)基因和400～800 的臨界表達(dá)基因的信號值）以及芯片上的陰性對照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余的數(shù)據(jù)，從剩下的基因中挑選至少有4 次Ratio 值的基因進(jìn)行t 檢驗(yàn)。計(jì)算得到的t 值如果大于0.05，則表明該基因在95%的水準(zhǔn)上為差異表達(dá)。最后挑選差異表達(dá)基因，即用SAM 軟件進(jìn)行分析，F(xiàn)DR 控制在5%以內(nèi)，再以1.5 倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因進(jìn)行片間校正和片內(nèi)歸一化，及信號可信度P 值分析、GO Terms 和Pathway Miner 分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 進(jìn)行方差分析。

1.6 熒光定量PCR 驗(yàn)證差異基因

1.6.1 模板的制備 按步驟1.5.1 節(jié)和1.5.2 節(jié)得到cDNA。

1.6.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)基因序列，利用Primer3.0進(jìn)行RT-qPCR 引物設(shè)計(jì)，具體引物信息見表1。

表1 RT-qPCR 引物信息Table 1 Primers used in the RT-qPCR

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 將合成的cDNA 模版稀釋成10-3，10-4，10-5和10-64 個濃度梯度作為模板進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中包括：0.8 μL 上游引物（10 μmol/L）、0.8 μL 下游 引 物 （10 μmol/L）、2 μL 模 板cDNA、10 μL SYBR Premix Ex TaqTM III，并用ddH2O 補(bǔ)足20 μL 體系。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸20 s，共35 個循環(huán)。

1.6.4 RT-qPCR 經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，確定合適的RT-qPCR 反應(yīng)體系和程序，對cDNA 分別進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出Ct 值，并利用Comparative Delta-delta Ct 法進(jìn)行相對定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素酶解試驗(yàn)

在相同溫度和pH 值下分別加入2%的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，酶解時(shí)間2.5 h。復(fù)合蛋白酶的水解度為78%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度分別為68%和60%，因此確定復(fù)合蛋白酶為水解酶。

從圖1可以看出，隨著時(shí)間的延長，水解度先緩慢升高后下降。當(dāng)水解時(shí)間為150 min 時(shí)，水解度最大；當(dāng)水解時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，酶解率下降（圖1a）。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，水解度最大；當(dāng)溫度大于55 ℃時(shí)，水解度又下降（圖1b）。當(dāng)加酶量大于2%時(shí)，酶解率逐漸上升（圖1c）。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝

2.2.1 因素選取及分析 選用復(fù)合蛋白酶進(jìn)行仿刺參水解的單因素分析，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，以水解度為響應(yīng)值，選取水解溫度、水解時(shí)間和加酶量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)次數(shù)為15，其中析因部分試驗(yàn)次數(shù)為12，中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)為3（表2）。

采用響應(yīng)面法分析試驗(yàn)結(jié)果，得到水解度為響應(yīng)值的回歸方程：仿刺參的水解度=80.18+5.54A+2.83B+10.09C-5.91AB+0.94AC-0.13BC-9.99A2-7.85B2-11.09C2。

利用Design Expert 軟件對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，并進(jìn)行方差分析，水解度回歸方程的顯著性檢驗(yàn)P<0.05，說明水解度試驗(yàn)中回歸模型的預(yù)測值均與實(shí)際值吻合，模型顯著；模型失擬項(xiàng)的P=0.2037（P>0.05），說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，即該方程與實(shí)際數(shù)據(jù)之間的擬合性好。另外，由統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出，模型的R2為0.9061。綜上所述，該試驗(yàn)方法可靠，可以用該模型分析和預(yù)測試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表3）。

圖1 各因素對仿刺參水解度的影響Fig.1 The effects of various factors on the DH of of Apostichopus joponicus

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the established native regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用及優(yōu)化 通過響應(yīng)面三維圖可對任何兩因素的交互影響及各因素對響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析和評價(jià)[16-17]，并從中確定最佳因素水平范圍[18]。圖2a～2c 分別表示了溫度和時(shí)間、溫度和加酶量、時(shí)間和加酶量3 組因素對水解度的影響。響應(yīng)面三維圖像的坡度大小反映響應(yīng)值對該因素的敏感程度[19]。本試驗(yàn)響應(yīng)面坡度陡峭，表明水解度受各因素影響大。

通過軟件分析、計(jì)算，得到一組最優(yōu)條件，對應(yīng)的編碼值分別為A：0.28；B：0.07；C：0.47，與之對應(yīng)的最佳工藝條件：酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間136 min，加酶量1.97%。在此條件下，響應(yīng)面預(yù)測的水解度最大值為83.29%。用上述優(yōu)化條件進(jìn)行試驗(yàn)，得到的水解度與理論值基本相符（圖2）。

圖2 各因素相互作用對水解度的影響Fig.2 The effect of the interaction of various factors on the degree of hydrolysis

2.3 血清生化指標(biāo)

與空白對照組相比，模型組大鼠血清中的UA、XOD 和BUN 水平明顯增高，分別達(dá)到96.79 μmol/L、14.59 U/L 和5.89 mmol/L，且差異顯著（P＜0.05）。仿刺參酶解液組大鼠喂藥后，血清中的UA和BUN 水平明顯下降，分別為67.16 μmol/L 和5.14 mmol/L；XOD 的活性也最小，為13.76 U/L（表4）。

表4 大鼠的血清UA，XOD 和BUN 水平（±s）Table 4 The serum UA，XOD and BUN levels of the rats （±s）

表4 大鼠的血清UA，XOD 和BUN 水平（±s）Table 4 The serum UA，XOD and BUN levels of the rats （±s）

注：a.P＜0.05；aa.P＜0.01。

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2.4 基因表達(dá)的差異

2.4.1 微陣列芯片分析結(jié)果 利用非監(jiān)督聚類的等階聚類方法（Hierarchical clustering）比較分析后，利用基因分布的火山圖展示基因表達(dá)差異性。上調(diào)基因少于下調(diào)基因（圖3）。

利用SAM 進(jìn)行分析，模型組和酶解液組分別聚為一類，兩者區(qū)分度高；在相同類別中，同一基因的表達(dá)情況基本相同，而不同類別間，同一基因的表達(dá)情況差異很大。芯片結(jié)果顯示，酶解液組和模型組比較，獲得差異基因179 個，其中36 個上調(diào)，143 個下調(diào)（圖4）。

圖3 大鼠基因分布的火山圖Fig.3 Volcano plots of gene distribution of rats

圖4 差異基因聚類分析Fig.4 Cluster analysis of differential gene

2.4.2 差異基因的GO 分析 酶解液組與模型組的差異基因本體聯(lián)合分析（Gene ontology，GO），在生物學(xué)過程分析大鼠差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，與調(diào)控相關(guān)的基因58.8%，與新陳代謝相關(guān)的基因14.7%。從細(xì)胞組分分析大鼠差異表達(dá)基因，與細(xì)胞成分相關(guān)的基因19.6%，細(xì)胞外基質(zhì)為17.6%，蛋白質(zhì)等其它大分子復(fù)合物為13.7%。從分子功能過程分析，具有結(jié)合功能的基因88.0%，具有催化活性的基因12.0%。痛風(fēng)與許多基因表達(dá)之間存在廣泛作用，而這些基因中含有某些關(guān)鍵代謝酶密碼，往往可以控制新陳代謝途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而對整個新陳代謝產(chǎn)生影響。食用仿刺參酶解液后，大鼠與結(jié)合功能相關(guān)的基因變化非常明顯，與調(diào)控相關(guān)的基因次之。

2.5 RT-qPCR 結(jié)果

本方法在稀釋為原濃度10-2，10-3，10-4和10-5模版濃度范圍內(nèi)取得了較好的線性關(guān)系。對通過基因芯片篩選的部分差異基因的RT-qPCR，分析顯示與基因芯片結(jié)果一致。如基因Krt14 的相對表達(dá)量，在基因芯片結(jié)果中酶解液組上調(diào)1.33倍，在定量PCR 結(jié)果中酶解液組上調(diào)1.25 倍。如基因SPP1 的相對表達(dá)量，在基因芯片結(jié)果中酶解液組下調(diào)1.3 倍，在定量PCR 結(jié)果中酶解液組下調(diào)1.5 倍。從圖中可以看出Krt14、Vim、Nime2、Spp1、Oash1h、Adora2a、Cck 這7 個基因，定量PCR結(jié)果和基因芯片結(jié)果一致；基因Mthfd1 和Gprotein，定量PCR 結(jié)果和基因芯片結(jié)果不一致；Flt1、Syp、Adss 這3 個基因，定量PCR 結(jié)果模型組和酶解液組沒有差異，基因芯片結(jié)果酶解液組表達(dá)量下調(diào)（圖5）。

圖5 RT-qPCR 結(jié)果Fig.5 The result of RT-qPCR

3 討論

目前，水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)水解，多用復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，或者采用兩種或幾種蛋白酶的復(fù)合物。向怡卉等[20]對海參生殖腺水解的研究采用的是復(fù)合蛋白酶。實(shí)際生產(chǎn)中，酶的選擇應(yīng)綜合水解效果、成本等因素。本文比較了復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在仿刺參水解過程中的作用效果，發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶水解效果最好，最佳條件加酶量為1.97%，水解時(shí)間136 min，水解溫度55 ℃。

黃嘌呤氧化酶（XOD）在尿酸生成過程中發(fā)揮著重要作用，直接調(diào)控著體內(nèi)尿酸水平的高低[21]?？讗偟萚22]研究表明，在高尿酸血癥時(shí)，XOD 活性會發(fā)生相應(yīng)變化。不少專家學(xué)者對9-苯基鳥嘌呤[23]、羥基胡椒酚等的相關(guān)抑制XOD 的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抑制XOD 活性是降低尿酸、預(yù)防痛風(fēng)的關(guān)鍵[24-25]。

仿刺參的脂肪含量低，蛋白質(zhì)含量高，富含人體所需的多種氨基酸。本研究表明，喂食仿刺參后大鼠體內(nèi)的血尿酸含量明顯降低，這說明仿刺參有抑制XOD 活性，改善高尿酸血癥的功效。同時(shí)，通過對黃嘌呤氧化酶的檢測，發(fā)現(xiàn)喂食仿刺參后，大鼠體內(nèi)的XOD 活性明顯降低，可以推測，仿刺參的作用機(jī)理主要是以黃嘌呤氧化酶為靶點(diǎn)，通過抑制其活性從而減少尿酸的合成，緩解高尿酸血癥及其并發(fā)癥的影響。

實(shí)踐證明生物體內(nèi)代謝酶的活性和濃度會因?yàn)椴煌臓I養(yǎng)條件而存在較大差異，這主要是由于食物中的營養(yǎng)物質(zhì)影響了基因的表達(dá)。當(dāng)某種營養(yǎng)素缺失或過多時(shí)，在分子水平上表現(xiàn)為某個或某些基因的開放、關(guān)閉或表達(dá)量的變化，雖然動物的遺傳特征不會因?yàn)闋I養(yǎng)素而改變，但它可以通過啟動或終止一些基因的表達(dá)而改變遺傳特征出現(xiàn)的時(shí)間框架。

喂食仿刺參后的大鼠基因表達(dá)出現(xiàn)明顯的差異，下調(diào)基因數(shù)量明顯多于上調(diào)基因的數(shù)量，差異基因包括能量代謝相關(guān)、糖代謝、細(xì)胞生長、合成及分解代謝、信號傳遞因子等。有一半的差異基因與疾病有關(guān)。

其中，酪氨酸（Ywhah2）可以使大鼠體內(nèi)寡腺嘌吟核苷酸減少，從而減少體內(nèi)尿酸的生成。分裂周期蛋白（Adora2a）可以和其它物質(zhì)結(jié)合生成異源二聚體復(fù)合物，參與磷酸化多種蛋白，調(diào)節(jié)DNA 復(fù)制。細(xì)胞凋亡（Cck）存在生物過程的各個階段。分泌性糖蛋白（Spp1）可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附和遷移，研究顯示Spp1 與疾病的嚴(yán)重程度有重大關(guān)系。食用酶解液的大鼠中這4 個基因均表達(dá)下調(diào)。2′-5′寡腺苷酸合成酶（Osa）在細(xì)胞膜受體等作用下，可以形成2-5 寡糖苷酸（2-5A），2-5A 特異性結(jié)合核酸內(nèi)切酶降解病毒的mRNA。食用酶解液的大鼠Osa 表達(dá)上調(diào)。路徑分析中可以看出，高尿酸血癥與肥胖、糖代謝、腫瘤有關(guān)，這與張長青等[26]、韓睿等[27]的研究結(jié)果一致。另有研究表明，痛風(fēng)或可降低阿爾茨海默病的發(fā)病率，在大鼠基因芯片路徑分析中可以看出糖代謝和阿爾茨海默病相關(guān)基因差異明顯。

結(jié)合前期差異基因結(jié)果和RT-qPCR 結(jié)果，對仿刺參酶解液抑制黃嘌呤氧化酶活性的作用機(jī)制進(jìn)行歸納。果糖1，6-二磷酸醛縮酶（Aldoa）是糖異生途徑中的關(guān)鍵酶催化1，6-二磷酸果糖生成6磷酸果糖。大鼠進(jìn)食蛋白含量很高的仿刺參酶解液之后，肝中糖原增加，糖的異生作用增強(qiáng)，因而氨基酸成糖成為氨基酸代謝的主要途徑。由基因芯片結(jié)果可以看出，果糖1，6-二磷酸醛縮酶基因上調(diào)明顯，故糖異生作用增強(qiáng)，氨基酸代謝主要通過糖異生轉(zhuǎn)化為糖，通過其它代謝途徑生成嘌呤、嘧啶的量減少。減少了大鼠體內(nèi)嘌呤的生成，緩解高尿酸血癥。