尤夢(mèng)晨 楊 平 宋煥祿* 張曉瑩 廖勇誠

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué)分子感官科學(xué)實(shí)驗(yàn)室 北京100048 2 雀巢研發(fā)（中國）有限公司 北京100095）

沙琪瑪也稱為“薩其馬”、“沙其瑪”等，是一種源于滿族的中國特色糕點(diǎn)。做法是將面條炸熟后，用糖混合成小塊制成，也是北京著名京式四季糕點(diǎn)之一，具有色澤米黃，口感酥松綿軟，香甜可口，桂花蜂蜜香味濃郁的特點(diǎn)[1]。

長期以來，沙琪瑪被大眾所喜愛，且銷售市場(chǎng)越來越廣[2]。目前國內(nèi)有關(guān)于沙琪瑪關(guān)鍵活性氣味物質(zhì)的分析與研究，如：王彥蓉等[3-4]對(duì)沙琪瑪貯存過程中風(fēng)味變化及品質(zhì)改善的研究，還有少量報(bào)道是針對(duì)不同種類原材料對(duì)沙琪瑪品質(zhì)影響的研究[5-12]。然而，沙琪瑪中除了一些令人愉悅的蛋香氣味之外，還有一些令人不愉快的異嗅味。為了能更好地找出沙琪瑪中有關(guān)雞蛋的風(fēng)味物質(zhì)及一些生產(chǎn)或貯存過程中產(chǎn)生的異嗅味，本試驗(yàn)采用固相 微 萃 取 法 （Solid -phase -micro -extraction，SPME）[13-17]和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜法（Gas chromatography-olfactrometry-mass spectrometry，GCO-MS）[18-24]結(jié)合技術(shù)對(duì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，從而找出沙琪瑪中存在與雞蛋風(fēng)味有關(guān)物質(zhì)和異嗅物，以改善產(chǎn)品的質(zhì)量。王彥蓉等[17]曾用固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用的前處理方法對(duì)沙琪瑪中風(fēng)味成分進(jìn)行萃取，鑒別出了沙琪瑪中的37 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售沙琪瑪。正己烷（色譜純），英國Fisher Scientific 公司；氦氣（99.999%），北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司；2-甲基3-庚酮 （0.816 μg/μL），美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄、75 μm CAR/PDMS 萃取頭、CAR/PDMS/DVB 萃取頭，美國Supelco 公司；固相微萃取頂空瓶 （100 mL），美國QEC 公司；HH-1 恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；微量注射器（10 μL）、7890A/7000B 氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)，美國Agilent 公司；JA5003 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DBWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱、DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱，美國J & W 公司；嗅聞儀Sniffer 9000，瑞士Brechbühler 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 取7 g 沙琪瑪樣品放入氣相頂空瓶中，用微量注射器吸取9～10 次正己烷進(jìn)行洗針，吸取預(yù)先配制好的0.816 μg/μL 的1 μL 2-甲基-3-庚酮于樣品中，擰緊瓶蓋。萃取條件：萃取溫度70 ℃，水浴平衡20 min，插入SPME 纖維頭，頂空萃取40 min。萃取完畢后，將SPME 纖維頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，于250 ℃條件下解吸5 min。

1.3.2 定量分析 在色譜分析中常用到的定量分析方法有歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)物加入法。本試驗(yàn)選用的是內(nèi)標(biāo)法作為定量分析[25]。

選用質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL 的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)，將配好的1 μL 2-甲基-3-庚酮溶液加入待平衡的樣品中?；衔锖坑?jì)算如式（1）：

式中，Sa——樣品a 的峰面積；Ss——內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Cs——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，μg/μL。

1.3.3 氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用分析 色譜條件：色譜柱：DB-WAX 型 （30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管柱；載氣：高純氦氣（99.999%）；恒流模式，流量：0.7 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣模式：分流（分流比10∶1）；色譜柱升溫程序：初始溫度40 ℃，保持時(shí)間10 min，以12 ℃/min 升至190℃，保持2 min，再以6 ℃/min 升至225 ℃，保持1 min，最后以6 ℃/min 升至250℃，保持2 min，總運(yùn)行時(shí)間為41 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜條件為電子轟擊離子源（Electron impact，EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，采集方式：全掃描（All scan）；掃描質(zhì)量范圍40～300 m/z。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 對(duì)固相微萃取的萃取頭（PDMS/CAR，CAR/PDMS/DVB），樣品量（6，7，8，9，10 g），平衡時(shí)間（10，15，20，25，30 min），吸附時(shí)間（30，35，40，45，50 min） 及 萃 取 溫 度（50，60，70，80，90 ℃）做單因素試驗(yàn)，初步找到最優(yōu)試驗(yàn)條件。通過GC-O-MS 技術(shù)，根據(jù)在嗅聞口聞到氣味的出峰時(shí)間以及在NIST 庫中檢索，找到既可以被質(zhì)譜分離又可以在嗅聞口聞到的19 種關(guān)鍵氣味物質(zhì)，最后運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)出峰面積及內(nèi)標(biāo)物濃度，計(jì)算出以上氣味物質(zhì)的濃度，再計(jì)算出總濃度進(jìn)行比較從而初步找到最優(yōu)萃取條件。

1.3.5 響應(yīng)面分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取法（SPME）萃取沙琪瑪中蛋香和蛋腥氣味活性化合物條件，最終得到最優(yōu)萃取條件。通過單因素試驗(yàn)，確定了沙琪瑪樣品量、試驗(yàn)溫度、吸附時(shí)間及平衡時(shí)間4 個(gè)單因素的最優(yōu)條件，各個(gè)因素間或多或少會(huì)存在相互影響，為確定這4 個(gè)因素之間的最佳比例，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4 因素3 水平響應(yīng)面分析方法，固相微萃取后的氣味活性化合物含量作為響應(yīng)指標(biāo)（Y）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 萃取頭的選擇 選用2 種固相微萃取頭 （即CAR/PDMS/DVB 萃取頭和75 μm CAR/PDMS萃取頭）萃取沙琪瑪?shù)膿]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖中可以看出，CAR/PDMS/DVB萃取頭所檢測(cè)出的色譜峰的數(shù)目要多于75 μm CAR/PDMS 萃取頭，且出峰密集，峰面積大，有較好的萃取效果。

2.1.2 樣品量的選擇 選擇樣品量6，7，8，9，10 g 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到沙琪瑪中具有蛋黃和蛋腥味的風(fēng)味物質(zhì)總含量如下圖所示，從圖3中可以明顯看出，在樣品量大于等于9 g 時(shí)，主要風(fēng)味物質(zhì)總含量明顯下降，分析原因可能是樣品量過多導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)不完全。樣品量為7 g 時(shí)，所需要的風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，因此選擇樣品量7 g為最優(yōu)條件。

2.1.3 平衡時(shí)間的選擇 選擇平衡時(shí)間10，15，20，25，30 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)得平衡時(shí)間與主要風(fēng)味物質(zhì)的總含量關(guān)系如圖4所示。從圖4看出，不同平衡時(shí)間與主要風(fēng)味物質(zhì)總含量之間變化不大。平衡時(shí)間為20 min 時(shí)，得到的風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，因此確定平衡時(shí)間20 min 為最優(yōu)條件。

2.1.4 吸附時(shí)間的選擇 選擇吸附時(shí)間30，35，40，45，50 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)得吸附時(shí)間與主要風(fēng)味物質(zhì)的總含量關(guān)系如圖5所示。從圖5看出，吸附時(shí)間過短導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)吸附不完全，吸附時(shí)間為40 min 時(shí)，得到的風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，因此確定吸附時(shí)間40 min 為最優(yōu)條件。

圖1 CAR/PDMS/DVB 萃取頭的色譜圖Fig.1 Chromatogram of CAR/PDMS/DVB extraction fibers

圖2 75 μm CAR/PDMS 萃取頭的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 75 μm CAR/PDMS extraction fibers

圖3 樣品量與主要風(fēng)味物質(zhì)總含量之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between the amount of sample and total concentration of main flavor substances

2.1.5 萃取溫度的選擇 選擇萃取溫度50，60，70，80，90 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)得萃取溫度與主要風(fēng)味物質(zhì)的總含量關(guān)系如圖6所示。從圖6看出，萃取溫度過高，部分風(fēng)味物質(zhì)揮發(fā)，因此萃取溫度為70 ℃時(shí)，得到的風(fēng)味物質(zhì)總含量最高，因此確定萃取溫度70 ℃為最優(yōu)條件。

圖4 平衡時(shí)間與主要風(fēng)味物質(zhì)總含量之間的關(guān)系Fig.4 The relationship between the equilibrium time and total concentration of main flavor substances

圖5 吸附時(shí)間與主要風(fēng)味物質(zhì)總含量之間的關(guān)系Fig.5 The relationship between the adsorption time and total concentration of main flavor substances

圖6 溫度與主要風(fēng)味物質(zhì)總含量之間的關(guān)系Fig.6 The relationship between the extraction temperature and total concentration of main flavor substances

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件

選擇濃醇雞蛋味沙琪瑪為試驗(yàn)材料，采用固相微萃取法直接萃取顆粒態(tài)樣品，選擇氣相進(jìn)樣口分流比10∶1 的條件下操作，纖維涂層材料的萃取頭為CAR/DVB/PDMS （碳分子篩/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷），樣品量為6，7，8 g，溫度為60，70，80 ℃，吸附時(shí)間為35，40，45 min，平衡時(shí)間為15，20，25 min，試驗(yàn)因素與水平見表1。

試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，其中交叉試驗(yàn)24 個(gè)，零點(diǎn)試驗(yàn)6 個(gè)，估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0 對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到沙琪瑪中蛋香和蛋腥氣味物質(zhì)的總含量對(duì)樣品量（A）、平衡時(shí)間（B）、吸附時(shí)間（C）、吸附溫度（D）的二次回歸方程模型為：Y=612.29-43.29A-20.07B+11.46C+125.26D+18.87AB+0.11AC+31.04AD-58.12BC-31.30BD-27.49CD-88.54A2-153.11B2-72.60C2-78.19D2。

設(shè)計(jì)中均經(jīng)過量綱編碼線性處理，因此各系數(shù)的正負(fù)以及絕對(duì)值大小直接反應(yīng)了各因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響程度。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

回歸模型整體為極顯著（P=0.0003<0.001），回歸模型的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.2907>0.05），說明該模型擬合度好，是可信的，可以用此模型檢驗(yàn)使用固相微萃?。⊿PME）提取沙琪瑪中蛋香和蛋腥氣味物質(zhì)的效果，探究因素的最優(yōu)響應(yīng)水平。通過軟件分析該回歸模型，R2=0.9578，R2Adj=0.9123，說明相應(yīng)指標(biāo)的變化有95.78%來源于優(yōu)化的因素因子，即樣品量、吸附溫度、吸附時(shí)間和平衡時(shí)間，回歸方程與實(shí)際值具有很高的擬合性，因此回歸方程可以代替真實(shí)值解釋響應(yīng)指標(biāo)結(jié)果。由表3可知，所選因素中吸附溫度D 對(duì)萃取效果極為顯著，樣品量A 對(duì)萃取效果高度顯著，樣品量A2、平衡時(shí)間B2、吸附時(shí)間C2、吸附溫度D2的二次項(xiàng)對(duì)萃取效果高度或極顯著，兩兩因素交互，即平衡時(shí)間與吸附時(shí)間BC 對(duì)萃取效果影響顯著。說明吸附溫度以及樣品量對(duì)SPME 的提取揮發(fā)性氣味物質(zhì)萃取效果影響顯著，而平衡時(shí)間和吸附時(shí)間對(duì)萃取效果影響不顯著，交互項(xiàng)樣品量與平衡時(shí)間、樣品量與吸附時(shí)間及樣品量與吸附溫度等對(duì)SPME萃取效果影響不顯著，說明這些條件的影響效果并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

通過Design-Expert 8.0 得出響應(yīng)曲面的形狀，響應(yīng)面的立體圖如圖7～12 所示，可以較直觀的看出各因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響，以及最優(yōu)和最佳因素水平。

圖7是萃取時(shí)間為40 min，溫度為70 ℃時(shí)，樣品量和平衡時(shí)間對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面，隨著平衡時(shí)間的延長，總含量不斷增加，隨著樣品量的增多，總含量變化不大。圖8～12 分別是樣品量和吸附時(shí)間，樣品量和吸附溫度，平衡時(shí)間和吸附時(shí)間，平衡時(shí)間和吸附溫度以及吸附時(shí)間和吸附溫度對(duì)峰總面積影響的響應(yīng)曲面。

根據(jù)Design-Expert 8.0 中的優(yōu)化選項(xiàng)的數(shù)字功能，運(yùn)用最大值優(yōu)化法，在模型范圍中選擇最低點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，優(yōu)化得到SPME 提取風(fēng)味化合物的最佳條件為樣品量6.74 g，平衡時(shí)間19.80 min，吸附時(shí)間40.20 min，吸附溫度73.9 ℃，預(yù)測(cè)該種條件下測(cè)得氣味活性化合物的總含量是652.919 ng/g。采用上述最優(yōu)萃取條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，萃取的揮發(fā)性化合物的總含量為633.88 ng/g，與預(yù)測(cè)值相差較小，說明該模型較優(yōu)化所得的萃取氣味化合物的參數(shù)可信度高，準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值?？紤]到實(shí)際情況，對(duì)萃取條件略微進(jìn)行調(diào)整，樣品量7 g，平衡時(shí)間20 min，吸附時(shí)間40 min，吸附溫度70 ℃。

圖7 樣品量和平衡時(shí)間對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the influence of sample amount and equilibrium time on the total concentration

圖8 樣品量和吸附時(shí)間對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the influence of sample amount and adsorption time on the total concentration

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要運(yùn)用固相微萃取法的前處理方法，利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-O-MS）技術(shù)對(duì)沙琪瑪中蛋香和蛋腥味氣味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。為更好的達(dá)到找尋沙琪瑪中蛋香和蛋腥味氣味物質(zhì)的效果，本試驗(yàn)首先對(duì)沙琪瑪?shù)妮腿☆^涂層、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、萃取溫度及樣品量做單因素試驗(yàn)，初步找到最優(yōu)條件，即選用沙琪瑪濃醇雞蛋味為試驗(yàn)樣品，選用3 涂層的CAR/PDMS/DVB 萃取頭，用固相微萃取的方法直接萃取顆粒狀樣品，氣相分析分流比10∶1 檢測(cè)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法得到最佳萃取條件為：平衡時(shí)間20 min，萃取時(shí)間40 min，萃取溫度70 ℃，樣品量7 g。為下一步沙琪瑪生產(chǎn)及貯藏過程中關(guān)鍵氣味活性化合物的定性、定量分析打下了基礎(chǔ)，以便于分析其變化規(guī)律，達(dá)到從風(fēng)味入手進(jìn)行品控的目的。

圖9 樣品量和吸附溫度對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of the influence of sample amount and extraction temperature on the total concentration

圖10 平衡時(shí)間和吸附時(shí)間對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.10 Response surface and contour map of the influence of equilibrium time and adsorption time on the total concentration

圖11 平衡時(shí)間和吸附溫度對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.11 Response surface and contour map of the influence of equilibrium time and extraction temperature on the total concentration

圖12 吸附時(shí)間和吸附溫度對(duì)總含量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.12 Response surface and contour map of the influence of adsorption time and extraction temperature on the total concentration