潘風(fēng)光 侯力簫 王 瑩 張 婷 劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 營養(yǎng)與功能食品研究室 長春130062）

肉雞加工過程中產(chǎn)生了大量的頭、骨、內(nèi)臟和羽毛等形式的固體副產(chǎn)物，這些廢棄物的不當(dāng)處理造成了環(huán)境污染、疾病和有效生物資源的流失[1]。然而，雞副產(chǎn)物中含有數(shù)量可觀的生物分子，如蛋白質(zhì)、酶和脂類等。這些分子可以回收，加工成在微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥、人類營養(yǎng)和化妝品等領(lǐng)域有價值的產(chǎn)品[2-3]。大豆粕是大豆制油后的副產(chǎn)物，油脂含量低，而含有大量的蛋白質(zhì)[4-5]。蛋白胨是由蛋白質(zhì)水解而制得的產(chǎn)品，作為培養(yǎng)基的重要原料之一，是微生物賴以生存、生長發(fā)育和繁衍后代的主要營養(yǎng)氮源[6]。將雞副產(chǎn)物和大豆粕進(jìn)行混合后提取蛋白，不僅可以豐富所制備蛋白胨的成分，也簡化了生產(chǎn)工藝。綜合利用農(nóng)產(chǎn)品加工過程中的副產(chǎn)物，提取高含量的蛋白質(zhì)，是解決蛋白質(zhì)資源日益短缺問題的重要途徑[7-8]。

目前對于蛋白提取的基本方法主要是堿溶酸沉法，然而傳統(tǒng)堿液提取法存在處理時間長，提取率低等問題。近年來超聲波技術(shù)在天然物質(zhì)提取方面顯示出強(qiáng)大的優(yōu)越性[9]。本文使用超聲波輔助堿溶法提取原料中的蛋白質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)初步確定各影響因子，采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出對蛋白提取率具有顯著性影響的因素，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，最終得出蛋白提取的最佳工藝，為后期酶解制備蛋白胨提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

脫脂雞副產(chǎn)物（干重比，雞骨∶雞內(nèi)臟=3 ∶1），其中雞內(nèi)臟干重比，雞心∶雞肝∶雞胗=1∶1∶1，吉林德惠食品有限公司；大豆粕，吉林德惠食品有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250（分析純），北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硼酸、硫酸銅、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純級。

CP124C 型電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；FK-A 型組織搗碎機(jī)，江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FW-400A 型傾斜式高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JJ-1 型精密定時電動攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JY92-2D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；CR20B2 型高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi 公司；K1100 型全自動凱氏定氮儀，海能儀器；FD-1C-50 型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)篩，紹興海特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助堿法提取混合蛋白的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將雞副產(chǎn)物與大豆粕分別粉碎過篩，按一定干重比混合，所得蛋白簡稱為CBSM（Chicken by-product and soybean meal）按照一定的液固比與不同濃度的氫氧化鈉溶液混合，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)輔助提取，調(diào)節(jié)功率與間隔時間，在一定溫度下攪拌提取一定時間。提取結(jié)束后以1 000 r/min 離心10 min，去除油層和沉淀，所得提取液用于測定比較各因素對蛋白提取率的影響[10]，各因素水平取值如下：

雞副產(chǎn)物與大豆粕的干重比 （g/g）：1∶3，1∶2，0∶1，1∶1，1∶0，2∶1，3∶1；CBSM 粒度 （目）：10，20，40，60，80，100，120；堿液質(zhì)量濃度（g/100 mL）：0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0；液固比：1∶1，5∶1，10∶1，15 ∶1，20∶1，25∶1，30∶1；超聲功率（W）：100，150，200，250，300，350，400；提取溫度（℃）：30，35，40，45，50，55，60；提取時間（h）：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5；提取次數(shù)（次）：1，2，3，4，5，6，7。

對以上8 個因素分別進(jìn)行5 水平的單因素試驗(yàn)，測定比較不同單因素對蛋白提取率的影響，利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出對指標(biāo)有顯著影響的因素繼續(xù)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定提取CBSM 蛋白的最優(yōu)工藝。本試驗(yàn)采用SPSS 軟件的one-way ANOVA 進(jìn)行各因素的顯著性分析，當(dāng)P<0.05 時，差異顯著。

1.2.2 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 Design-Expert8.0 設(shè)計(jì)PB 試驗(yàn)[11-12]根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個因素取較優(yōu)的兩個水平，采用Design-Expert8.0 軟件選用N=12，進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對CBSM 原料干重比（X1）、CBSM 粒度（X2）、堿液質(zhì)量濃度（X4）、液固比（X5）、超聲功率（X7）、提取溫度（X8）、提取時間（X10）、提取次數(shù)（X11），以及3 個虛擬變量X3、X6、X9進(jìn)行篩選，每個因素取高水平（+1）和低水平（-1）兩個水平，其中高水平取低水平的1.5 倍，以蛋白提取率為指標(biāo)，按表1設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Variables and levels in the Plackett-Burman experimental design

1.2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)最陡爬坡路徑可以確定各試驗(yàn)因素的最適條件范圍，根據(jù)PB 試驗(yàn)結(jié)果，由主要影響因素的偏回歸系數(shù)的正負(fù)值來確定各因素的爬坡方向，再根據(jù)效應(yīng)值的大小確定步長，進(jìn)而可以快速接近最大響應(yīng)值[13-14]。

1.2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在PB 試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白提取率為指標(biāo)，分別考察堿液質(zhì)量濃度（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）3個因素對蛋白提取率的影響，試驗(yàn)因素及水平表如表2所示。

1.2.3 CBSM 蛋白質(zhì)的分離純化

1.2.3.1 CBSM 蛋白等電點(diǎn)的確定[15]最優(yōu)條件下提取蛋白后，所得提取液分裝于50 mL 離心管中，每管30 mL，用1 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)各管pH 值分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，沉淀析出后于4 ℃冰箱中靜置2 h，再經(jīng)過4 000 r/min 離心10 min，去上清液，沉淀后的蛋白質(zhì)用透析袋置于蒸餾水中，每隔2 h 將蒸餾水更換一次，24 h 后停止，脫鹽處理完畢[16]。將沉淀干燥、粉碎，測定產(chǎn)物的蛋白含量。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平表Table 2 Factors and levels in Box-Behnken

1.2.3.2 提取液及沉淀物中蛋白含量的測定 采用凱氏定氮法測定CBSM 混合原料及沉淀物中蛋白含量。采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中蛋白含量[17]，繪制出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

圖1為考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.0053x+0.0141，相關(guān)系數(shù)R2=0.9965，OD595nm與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度之間線性關(guān)系良好。用同樣的方法稀釋待測蛋白提取液，測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到蛋白含量[18]。

2.2 超聲波輔助堿法提取CBSM 混合蛋白單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CBSM 原料干重比對蛋白質(zhì)提取率的影響圖2為雞副產(chǎn)物與大豆粕干重比例對蛋白提取率影響結(jié)果。其中干重比0∶1 表示只使用大豆粕為原料，干重比1∶0 表示只使用雞副產(chǎn)物為原料。從中可以看出，將雞副產(chǎn)物與大豆粕進(jìn)行混合提取所得提取率顯著高于使用單一原料時的結(jié)果。隨著雞副產(chǎn)物與大豆粕干重比的增加，提取效果增強(qiáng)，且當(dāng)干重比達(dá)到3∶1 時，蛋白提取率最大，可能是由于雞副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量要高于大豆粕中蛋白質(zhì)含量。因此，選擇干重比為3∶1 作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.2.2 CBSM 粒度對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，隨著CBSM 粒度的增加，蛋白提取率先上升后下降?？梢钥闯隽６葟?0 目到80 目時，由于顆粒細(xì)度減小，接觸面積增大，提取率明顯增大，且80 目和100 目的結(jié)果差異不顯著（P>0.05）；超過100 目后，蛋白溶出率降低，可能由于粒度過小，使其它可溶性物質(zhì)一起析出，降低了溶液中蛋白含量。綜合考慮，選擇過80 目篩作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

圖1 考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carve of Coomassie brilliant blue

圖2 CBSM 原料干重比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of different CBSM dry weight ratio on extraction of protein

2.2.3 堿液質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)堿液質(zhì)量濃度由0.1 g/100 mL 增大到1.0 g/100 mL 時，蛋白提取率隨之提高，且結(jié)果差異顯著（P<0.05）。質(zhì)量濃度從1.0 g/100 mL 增大到1.5 g/100 mL 過程中，提取率雖稍有下降，但不顯著，超過1.5 g/100 mL 后，提取率顯著下降，這可能是由于高質(zhì)量濃度的堿液使蛋白質(zhì)特性發(fā)生改變，氫鍵斷裂；也可能由于產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，提取物中非蛋白雜質(zhì)增多，從而降低了蛋白的提取率[19]。因此，選擇堿液質(zhì)量濃度為1.0 g/100 mL 作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.2.4 液固比對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可以看出，蛋白提取率隨液固比的增大而不斷提高，從1∶1 上升到15∶1 時，其效果差異顯著（P<0.05），超過15 ∶1 后，雖然結(jié)果仍舊上升，但差異不顯著（P>0.05），蛋白質(zhì)提取率基本趨于平穩(wěn)。這可能是由于蛋白在溶液中的溶解度有限，溶液飽和提取率也無明顯提升，而且液固比過大，會增加提取后廢水處理步驟，造成原料浪費(fèi)。綜合考慮，選擇液固比為15∶1 作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.2.5 超聲功率對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖6可知，蛋白提取率隨超聲功率的增大先上升后下降，且功率在300 W 時，提取率最高，各水平提取效果差異顯著（P<0.05）。當(dāng)功率超過300 W 時，提取率下降，這可能是過高的超聲功率會對原料蛋白產(chǎn)生一定的破壞作用，從而降低了蛋白提取率。因此，選擇超聲功率300 W 作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

圖3 CBSM 粒度對蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of different CBSM particle size on extraction of protein

圖4 堿液質(zhì)量濃度對蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of different lye mass concentration on extraction of protein

圖5 液固比對蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of different liquid-solid ratio on extraction of protein

圖6 超聲功率對蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic power on extraction of protein

圖7 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of different extraction temperature on extraction of protein

圖8 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.8 Effects of different extracting time on extraction of protein

圖9 提取次數(shù)對蛋白提取率的影響Fig.9 Effects of different extracting times on extraction of protein

2.2.6 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖7可以看出，蛋白提取率隨提取溫度的升高先增大后減小，這是由于升溫可以加速分子間的運(yùn)動，使其結(jié)構(gòu)展開，促進(jìn)物質(zhì)產(chǎn)生沉淀，蛋白質(zhì)可以快速地從原料中分離出來，增大蛋白提取率。在40 ℃時提取率達(dá)到最大；超過45 ℃后，提取率下降，因?yàn)楦邷貢?dǎo)致蛋白質(zhì)變性，直接影響蛋白得率。綜上所述，選擇提取溫度為40 ℃作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.2.7 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖8可以看出，提取時間在0.5～2.0 h 之間，提取率逐漸增大，且在2.0 h 時達(dá)到最大。隨著提取時間的延長，原料中蛋白逐漸溶解出來，然而過長的提取時間會導(dǎo)致提取溶液中的溶劑損失，造成液固比減少，使溶液pH 發(fā)生變化，蛋白質(zhì)變性，蛋白提取率降低[20]。綜上所述，選擇提取時間2.0 h 作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.2.8 提取次數(shù)對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖9可知，提取多次后蛋白提取率會增大，且提取2 次后的效果顯著高于提取1 次的效果，然而超過2次后，蛋白提取率的變化不顯著（P＞0.05），浪費(fèi)人力物力。由于提取次數(shù)與液固比直接相關(guān)，優(yōu)化其它條件可顯著減少試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，因此，從降低成本的角度考慮，選擇提取次數(shù)1 次作為后續(xù)PB 試驗(yàn)的低水平。

2.3 超聲波輔助堿法提取CBSM 混合蛋白的PB 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)結(jié)果 以蛋白提取率（M，%）為指標(biāo)，考察CBSM 原料干重比（X1）、CBSM 粒度（X2）、堿液質(zhì)量濃度（X4）、液固比（X5）、超聲功率（X7）、提取溫度（X8）、提取時間（X10）、提取次數(shù)（X11），以及3 個虛擬變量X3、X6、X9對蛋白提取率的影響，從中篩選出顯著因素，PB 試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表4為PB 試驗(yàn)方差分析表，從中可以看出，該模型F 值為29.53，P=0.0090＜0.01 極顯著，R2=0.9875，表示相關(guān)性良好，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9540，表示95.40%試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型解釋。此模型變異系數(shù)CV=3.95%，表示該P(yáng)B試驗(yàn)的可信度和精確度較好，模型方程能夠較好地反映出試驗(yàn)值的真實(shí)性。精密度=12.2448＞4，視為合理，擬合度高，故可用該模型分析影響蛋白提取率的顯著因素[14]。由表4可知，超聲功率（X7）和提取溫度（X8）對蛋白提取率的影響極顯著（P＜0.01），堿液質(zhì)量濃度（X4）對蛋白提取率的影響顯著（P＜0.05），且顯著性X7＞X8＞X4，即超聲功率＞提取溫度>堿液質(zhì)量濃度，而其它5 個因素對蛋白提取率的影響不顯著（P>0.05），因此，選擇堿液質(zhì)量濃度、超聲功率、提取溫度3 個因素作為下一步試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and corresponding results of Plackett-Burman experimental

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)變量方差分析Table 4 Analysis of variance for Plackett-Burman experimental design

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果 由表5可以確定最陡爬坡試驗(yàn)方向。在顯著性因素中，X4、X7對蛋白提取率的影響是正效應(yīng)，取值應(yīng)逐漸增大，而X8的影響是負(fù)效應(yīng)，取值應(yīng)逐漸減小；在非顯著性因素中，X11的影響是正效應(yīng)，應(yīng)取其高水平，而X1，X2，X5，X10的影響是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)取其低水平。根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果初步確定非顯著因素的水平分別為：原料干重比為3∶1、CBSM 粒度為80目、液固比為15 ∶1、提取時間為2 h、提取次數(shù)為2 次。

根據(jù)表6結(jié)果可以看出，隨著堿液質(zhì)量濃度和超聲功率逐漸增大，提取溫度逐漸減小，蛋白提取率呈先升高后降低的趨勢。試驗(yàn)號3 的蛋白提取率最高，表明最大響應(yīng)值區(qū)域在第3 號試驗(yàn)附近。因此選擇堿液質(zhì)量濃度0.725 g/100 mL、超聲功率365 W、提取溫度42 ℃為中心值，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.3.3.1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果 通過Design Expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken 試驗(yàn)，得到蛋白提取率（Y）與堿液質(zhì)量濃度（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）3 個因素之間的關(guān)系，見表7。得到二次多項(xiàng)式回歸模型方程：Y=54.66-1.01A-0.69B+0.80C-0.77AB+1.41AC+1.27BC-2.00A2-3.46B2-3.84C2。

表5 Plackett-Burman 試驗(yàn)中因素的正負(fù)相關(guān)性分析Table 5 Analysis of negative and positive correlation of factors in Plackett-Burman experimental

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of the steepest ascent experiment

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Box-Behnken design and corresponding experimental results

對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。該模型P＜0.0001，表示二次方程模型極顯著。失擬項(xiàng)F 值=0.081，P=0.9666＞0.05，表示失擬項(xiàng)相對于絕對誤差不顯著，可取[21]。圖10反映了蛋白提取率的實(shí)際值與預(yù)測值之間的相關(guān)性，且該模型R2=0.9750，表明97.50%的數(shù)據(jù)可用該方程解釋，實(shí)際值與預(yù)測值之間的殘差呈正態(tài)分布，具有良好的線性分布。R2Adj=0.9429，說明擬合度良好，可用于蛋白提取分析。由表8可以看出，因素A 極顯著，而因素B 和因素C 顯著，二次項(xiàng)都極顯著，相互項(xiàng)AB 不顯著，AC 極顯著，BC 顯著。

表8 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析Table 8 Analysis of variance of Box-Behnken design

圖10 蛋白提取率實(shí)測值與預(yù)測值之間的相關(guān)性及殘差的正態(tài)分布Fig.10 The correlation of the actual and predicted values of protein extraction rate and the normal distribution of residuals

2.3.3.2 響應(yīng)面交互作用及響應(yīng)曲面分析 通過響應(yīng)曲面分析可以直觀地看出試驗(yàn)中不同因素對蛋白提取率的影響，以及兩兩因素相互作用對蛋白提取率的影響[16]。各因素的交互作用的等高線圖以及3D 立體圖如圖11～圖13所示。

從圖11可以看出堿液質(zhì)量濃度和超聲功率之間交互作用對蛋白提取率的影響不顯著，曲線比較平緩，且增大堿液質(zhì)量濃度或是超聲功率，蛋白提取率先增后減，變化幅度很小。堿液質(zhì)量濃度和超聲功率分別在0.70～0.75 g/100 mL 和360～370 W 之間時，蛋白提取率達(dá)到最大值。

由圖12可以看出提取溫度對應(yīng)的響應(yīng)曲面坡度比較陡峭，堿液質(zhì)量濃度變化對蛋白提取率的影響較大，且曲線出現(xiàn)最高點(diǎn)，表明堿液質(zhì)量濃度和提取溫度之間交互作用對蛋白提取率的影響極顯著。堿液質(zhì)量濃度和提取溫度分別在0.70～0.75 g/100 mL 和40～44 ℃之間，蛋白提取率可以達(dá)到最大值。

圖13顯示出超聲功率和提取溫度之間的交互作用對蛋白提取率的影響比較顯著，且超聲功率和提取溫度分別在360～370 W 和40～44 ℃之間時，蛋白提取率可以達(dá)到最大值。

圖11 Y=f（A，B）等高線圖及響應(yīng)曲面立體圖Fig.11 The contour map plot and response surface plot for Y=f（A，B）

圖12 Y=f（A，C）等高線圖及響應(yīng)曲面立體圖Fig.12 The contour map plot and response surface plot for Y=f（A，C）

圖13 Y=f（B，C）等高線圖及響應(yīng)曲面立體圖Fig.13 The contour map plot and response surface plot for Y=f（B，C）

2.3.3.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件分析得出超聲波輔助提取CBSM 混合蛋白的最佳條件：堿液質(zhì)量濃度0.71 g/100 mL，超聲功率363.35 W，提取溫度42.21 ℃，得到的蛋白提取率為54.82%。結(jié)合實(shí)際操作，選擇堿液質(zhì)量濃度為0.70 g/100 mL，超聲功率為365 W，提取溫度為42 ℃，采用上述優(yōu)化條件提取蛋白，平行測定3 次，最終得出蛋白提取率的實(shí)際值分別為53.32%，55.54%，55.02%，平均值為54.63%，與預(yù)測值十分吻合。

2.4 CBSM 蛋白等電點(diǎn)的確定

按照干重比為3∶1，準(zhǔn)確稱取適量的脫脂雞副產(chǎn)物和大豆粕分別粉碎過篩后進(jìn)行混合，用0.70 g/100 mL 的氫氧化鈉溶液配成液固比為15 ∶1 的樣品溶液，于42 ℃下超聲堿溶提取2 h，其中超聲功率為365 W，間隔時間30 s，在此條件下提取2 次后，以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，去除油層和沉淀，得到提取液。

取7 個50 mL 的離心管，每管中各加入30 mL 上述提取液，用1 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)各管pH值分別為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，待沉淀析出后于4 ℃冰箱中靜置2 h，再經(jīng)過4 000 r/min 離心10 min，去上清液，沉淀后的蛋白質(zhì)用透析袋放置于蒸餾水中，每隔2 h 將蒸餾水更換1 次，24 h后，脫鹽處理完畢[16]。真空冷凍干燥、粉碎、過篩，稱取沉淀物質(zhì)量，計(jì)算沉淀率。此操作重復(fù)測定3次，計(jì)算平均值，以pH 值為橫坐標(biāo)，所得沉淀率為縱坐標(biāo)，繪制柱狀圖，確定出沉淀率最大時的pH 值即為該CBSM 蛋白的等電點(diǎn)，測定結(jié)果見圖14。

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時蛋白會析出，出現(xiàn)渾濁或產(chǎn)生沉淀，由圖14可以看出，隨著pH 值的變化，CBSM 蛋白的沉淀率也相應(yīng)變化，蛋白沉淀率在pH 值為4.0 時出現(xiàn)最大值，達(dá)到70.07%。因此，CBSM 蛋白的等電點(diǎn)（PI）為4.0，將提取液在該pH值條件下沉淀，測定提取后的蛋白含量為62.64%。

3 結(jié)論

圖14 CBSM 蛋白等電點(diǎn)測定結(jié)果Fig.14 The determined results of CBSM protein isoelectric point

采用超聲波輔助堿法提取雞副產(chǎn)物-大豆粕混合蛋白中蛋白質(zhì)的工藝。本試驗(yàn)利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)篩選出影響蛋白提取率的顯著性因素為：堿液質(zhì)量濃度、超聲功率和提取溫度。利用響應(yīng)面分析對超聲波輔助堿法提取CBSM 蛋白工藝進(jìn)行優(yōu)化，以蛋白提取率為響應(yīng)值，確定最優(yōu)提取條件：原料干重比為3∶1、CBSM 粒度為80 目、堿液質(zhì)量濃度為0.70 g/100 mL、液固比為15∶1、超聲功率為365 W、提取溫度為42 ℃、提取時間為2 h、提取次數(shù)為2 次。該條件下經(jīng)過3 次平行試驗(yàn)，所得蛋白提取率為54.63%。經(jīng)測定該蛋白在pH 值為4.0 時達(dá)到等電點(diǎn)，沉淀后所得提取蛋白含量為62.64%。