朱建宇 趙城彬 江連洲 謝鳳英*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長春130118）

大豆自古以來是我國居民飲食的重要組成部分，是植物蛋白的主要資源之一。與動物蛋白相比，大豆蛋白中必需氨基酸的比例更適合人體需要，其精氨酸含量比牛奶高，而且不含膽固醇。大豆蛋白不僅具有較高的營養(yǎng)價值，而且具有多種功能特性，如溶解性、起泡性、凝膠性和乳化性等，這些功能特性在食品生產(chǎn)加工中具有重要的作用[1]。蛋白的功能特性不僅與蛋白本身結(jié)構(gòu)有關(guān)，加工過程中由于環(huán)境因素的改變引起的蛋白結(jié)構(gòu)改變也將對其功能特性產(chǎn)生顯著影響[2-3]。大豆蛋白在生產(chǎn)加工過程中通常會受到熱處理、酸堿處理和鹽處理等，不同的加工處理會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。事實上，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)（分子尺寸、亞基組成、空間結(jié)構(gòu)等）與環(huán)境因素（溫度、pH 值和離子強度等）對蛋白質(zhì)的功能特性均有影響。近年來，大多數(shù)研究主要以大豆分離蛋白為對象，探討理化因素對其結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，很少對β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）的結(jié)構(gòu)和功能特性進行研究，并缺乏特定條件下大豆球蛋白空間結(jié)構(gòu)和溶液性質(zhì)的信息。大豆蛋白質(zhì)主要由7S 球蛋白和11S 球蛋白組成[4]。11S 球蛋白具有緊密的分子結(jié)構(gòu)，多數(shù)活性基團被包裹在球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部，一般的處理方法很難使其球狀結(jié)構(gòu)展開，從而有效提高其功能特性。與7S 球蛋白相比，11S 球蛋白是限制大豆蛋白應(yīng)用和改性的關(guān)鍵因素[5]。

目前，關(guān)于堿性條件下大豆11S 球蛋白溶液性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的研究鮮有報道。本試驗對堿性條件下大豆11S 球蛋白溶解性、表面疏水性、Zeta電位以及粒徑進行測定，同時采用拉曼光譜技術(shù)對蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)進行研究，為大豆蛋白功能性質(zhì)的改善及功能性大豆蛋白產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)46），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；8-苯胺基-1-萘磺酸 （ANS），美國Sigma 公司；Lowry 法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒，上海荔達生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫高速離心機，美國Beckman 公司；AKTA-蛋白質(zhì)純化儀，美國GE 公司；F-4500 熒光分光光度計，日本Hitachi 公司；ZetaPALS-Zeta 電位儀、ZetaPALS-激光粒度分析儀，美國布魯克海文儀 器 公 司；PerkinElmer Raman Station 400 拉 曼光譜儀，美國PE 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆11S 球蛋白的制備 大豆11S 球蛋白的制備根據(jù)Nagano 等[6]的方法。大豆→脫皮→粉碎→過60 目篩→正己烷脫脂→脫脂大豆粉→與水混合（料液比1∶15）→調(diào)節(jié)pH 7.5→提取2 h→離心分離（10 000×g，15 min）→上清液→添加亞硫酸鈉 （0.98 g/L）→提取1 h→調(diào)節(jié)pH 6.4→4 ℃過夜→離心分離（12 000×g，20 min）→沉淀→凍干→大豆11S 球蛋白粗提物。

應(yīng)用AKTA-蛋白質(zhì)純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade 凝膠制備級預(yù)裝柱，對大豆11S 球蛋白粗提物進行純化，并進一步采用SDS-PAGE 分析蛋白質(zhì)組成，通過光密度掃描測得大豆11S 球蛋白純度約為92%。

1.3.2 不同pH 值緩沖溶液的配制 配制0.01 mol/L 的pH 7～9 的Tris-HCl 緩沖液，pH 10 的甘氨酸-HCl 緩沖液，pH 11～12 的NaOH-NaH2PO4緩沖液。

1.3.3 溶解性的測定 參考Samoto 等[7]的方法。稱取100 mg 大豆11S 球蛋白樣品分散于10 mL去離子水中，磁力攪拌30 min 后，在12 000×g 下離心20 min。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowry 法測定稀釋后的上清液中蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液中蛋白的質(zhì)量與樣品中總蛋白質(zhì)量的比值。

1.3.4 表面疏水性的測定 采用ANS 熒光探針法測定蛋白質(zhì)表面疏水性[8]。將大豆11S 球蛋白樣品溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中配成10 mg/mL的蛋白溶液，室溫條件攪拌1 h 后在10 000×g 下離心30 min，上清液用相同的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.07～0.67 mg/mL （采用Lowry 法測定蛋白濃度）。分別取不同濃度的樣品溶液4 mL，加入8 mmol/L 的ANS 溶液40 μL，充分振蕩混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強度（FI）。激發(fā)波長λex為390 nm，發(fā)射波長λem為470 nm，夾縫寬均為5 nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性（H0）。

1.3.5 Zeta 電位的測定 根據(jù)Crudden[9]的測定方法，采用ZetaPlus Zeta 電位儀測定大豆11S 球蛋白溶液的Zeta 電位。將11S 球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質(zhì)量分數(shù)為0.2%，上樣體積為1 mL。Zeta電位測定條件：聚苯乙烯池（1 cm）若干，鉑電極（0.45 cm2，間距0.4 cm）一對。溫度為25 ℃，溫度平衡時間為2 min。

1.3.6 粒徑分布的測定 根據(jù)李楊等[10]的測定方法，采用ZetaPlus 粒度分析儀測定大豆11S 球蛋白的平均粒徑分布。將11S 球蛋白樣品用磷酸緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.2%的溶液。過0.45 μm 水系醋酸纖維素濾膜，室溫條件下測量。

1.3.7 拉曼光譜的測定 參考張萍等[11]的測定方法，將大豆11S 球蛋白用緩沖溶液配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的溶液進行拉曼測定。激發(fā)光波長設(shè)定為785 nm，激光功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4次掃描進行累加。拉曼圖譜處理：譜圖基線校正、譜峰查找采用ACD Labs V12 軟件，以苯丙氨酸【（1 003±1）cm-1】作為歸一化因子，以此作為各拉曼峰強度變化的依據(jù)，得到不同條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜，采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1 軟件計算大豆11S 球蛋白各結(jié)構(gòu)的百分含量。

1.4 統(tǒng)計分析

每個樣品重復(fù)3 次試驗，ANOVA 差異顯著性分析利用SPSS V17.0 軟件完成，P＜0.05 為顯著性差異，采用Origin8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性條件下大豆11S 球蛋白的溶解性和表面疏水性分析

圖1為堿性條件下大豆11S 球蛋白的溶解性和表面疏水性，由圖1可知，堿性（pH 7.0～12.0）條件下，隨著pH 值的增加，大豆11S 球蛋白的溶解性逐漸增強，表面疏水性（H0）逐漸降低，這表明堿性條件下蛋白質(zhì)的H0與溶解性呈負相關(guān)。Paraman 等[12]在對大米蛋白理化性質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)溶解性與H0呈負相關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。當(dāng)pH 值由7.0 增加到12.0 時，蛋白分子間靜電斥力增加，大豆11S 球蛋白空間結(jié)構(gòu)在一定程度上去折疊展開，同時亞基之間二硫鍵發(fā)生斷裂，增強了蛋白質(zhì)的水合作用，阻止蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[13]，導(dǎo)致溶解性增強；同時堿性pH 作用會誘導(dǎo)蛋白分子發(fā)生重排，使疏水基團位于蛋白分子內(nèi)部，導(dǎo)致H0降低。此外，高溶解性蛋白質(zhì)表面暴露的疏水殘基較少[14]，也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)H0降低。

由于食品加工過程中不涉及極端酸堿處理，且在pH 10.0～12.0 范圍內(nèi)，大豆11S 球蛋白的溶解性和H0的變化不顯著，因此，選取pH 7.0～10.0范圍進行大豆11S 球蛋白的Zeta 電位、粒徑以及分子結(jié)構(gòu)研究。

2.2 堿性條件下大豆11S 球蛋白的Zeta 電位和粒徑分析

Zeta 電位是表征蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)和分散穩(wěn)定性的重要參數(shù)，一般來說，蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸多于帶負電荷的氨基酸，其蛋白質(zhì)溶液Zeta 電位為正值；反之，蛋白質(zhì)表面帶負電荷的氨基酸多于帶正電荷的氨基酸時，蛋白質(zhì)溶液Zeta電位呈負值[15]。溶液的pH 值會影響蛋白質(zhì)分子表面帶電基團的離子化程度，引起蛋白質(zhì)分子表面帶電氨基酸發(fā)生重新排布，導(dǎo)致蛋白溶液的Zeta電位發(fā)生改變[16]。采用Zeta 電位儀對堿性條件下大豆11S 球蛋白溶液的Zeta 電位進行測定，結(jié)果如圖2所示。在所測試的pH 7.0～10.0 范圍內(nèi)，pH呈堿性，所有蛋白樣品的Zeta 電位均為負值，說明堿性條件下大豆11S 球蛋白表面羧基解離，以負離子形式存在。隨著pH 值的升高，大豆11S 球蛋白溶液Zeta 電位的絕對值逐漸增大。分析原因在于pH 通過影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈羧基及氨基的解離程度來影響蛋白表面所帶電荷[17]。隨著pH 值的升高，蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈上的極性基團（如羧基、羥基和氨基） 更多的暴露于大豆球蛋白分子表面并逐漸發(fā)揮作用，使大豆球蛋白表面所帶的電荷增多，導(dǎo)致溶液Zeta 電位的絕對值增加。

采用激光粒度分析儀測定堿性條件下大豆11S 球蛋白的粒徑分布，平均粒徑結(jié)果如圖2所示。在pH 7.0～10.0 的范圍內(nèi)，大豆11S 球蛋白質(zhì)溶液的平均粒徑分布在89.1～111.8 nm 范圍內(nèi)，隨著pH 值的升高，平均粒徑整體呈下降趨勢，在pH 9 時略有波動。通常蛋白質(zhì)溶液的粒徑大小取決于蛋白質(zhì)的聚集程度[18]，由于溶液pH 值的改變影響了大豆球蛋白分子表面的電荷分布，使靜電相互作用增大，分子間斥力增強，蛋白分子處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，不易發(fā)生聚集，從而使溶液中11S 球蛋白平均粒徑降低。此外，蛋白溶液中單個蛋白質(zhì)分子和大粒徑的可溶性聚集物同時存在，這可能就是導(dǎo)致堿性條件下（pH 7.0～10.0）大豆11S 球蛋白的平均粒徑呈現(xiàn)波動變化的一個原因。

綜合Zeta 電位和平均粒徑分析可知，在堿性條件下，大豆球蛋白表面負電荷增多，更多同性電荷之間的靜電排斥作用使蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性增強，降低了蛋白質(zhì)之間的聚沉幾率，蛋白質(zhì)的溶解性增大，同時更多的極性氨基酸暴露于蛋白質(zhì)表面可能會導(dǎo)致H0降低。

圖1 堿性條件下大豆11S 球蛋白的溶解性和表面疏水性Fig.1 Solubility and surface hydrophobicity of 11S glycinin at alkaline condition

2.3 堿性條件下大豆11S 球蛋白的拉曼光譜分析

采用拉曼光譜對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及疏水微環(huán)境進行分析，以拉曼光譜特征吸收峰的相對強度來表示蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的定量信息[19]。圖3為堿性條件下大豆11S 球蛋白的拉曼光譜圖。由于拉曼光譜圖中特征峰的強度與蛋白質(zhì)中特定基團或化學(xué)鍵的數(shù)目成正比，當(dāng)特征峰的強度發(fā)生改變時，說明蛋白質(zhì)分子中特定基團或化學(xué)鍵的數(shù)目發(fā)生了改變[20]。

圖3 堿性條件下大豆11S 球蛋白的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of 11S glycinin at alkaline condition

2.3.1 堿性條件下大豆11S 球蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1 軟件對大豆11S 球蛋白的拉曼圖譜二級結(jié)構(gòu)進行定量計算，利用酰胺I 帶和酰胺III 帶擬合大豆11S 球蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 酰胺I 帶擬合堿性條件下大豆11S 球蛋白二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of 11S glycinin by amide I bands at alkaline condition

由表1利用酰胺I 帶擬合結(jié)果可以看出，在pH 7.0～10.0 范圍內(nèi)，隨著pH 值的升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸增加，β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量逐漸降低，pH 值的改變對β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量影響不顯著。由表2利用酰胺III 帶擬合結(jié)果可以看出，在pH 7.0～10.0 范圍內(nèi)，隨著pH 值的升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸增加，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量逐漸降低，pH 值的改變對β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量影響不顯著。綜上所述，根據(jù)酰胺I 帶和酰胺III帶大豆11S 球蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化可知，雖然利用酰胺I 帶和酰胺III 帶分析出來的大豆11S球蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分含量存在一定差異，但pH對α-螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果是一致的。通過與表面疏水性變化規(guī)律相關(guān)性分析表明，在堿性（pH 7.0～10.0）條件下，大豆11S 球蛋白的表面疏水性與α-螺旋結(jié)構(gòu)含量呈顯著負相關(guān)（r=-0.786，P＜0.05），與無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量呈顯著正相關(guān)（r=0.792，P＜0.05）。魏冬旭等[21]采用圓二色譜研究pH 值對大豆11S 球蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，得到的結(jié)果與本文研究結(jié)果一致。

表2 酰胺III 帶擬合堿性條件下大豆11S 球蛋白二級結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of 11S glycinin by amide III bands at alkaline condition

2.3.2 堿性條件下大豆11S 球蛋白氨基酸側(cè)鏈分析 蛋白質(zhì)拉曼光譜的850 cm-1和830 cm-1譜峰是酪氨酸殘基的對位取代苯的有關(guān)振動，由于環(huán)的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間的費米共振，兩譜峰成對出現(xiàn)。兩峰的強度比（I850/I830）為費米共振線，可用來表征酪氨酸殘基的包埋與暴露情況[22]。當(dāng)I850/I830比值為0.3～0.5 時，酪氨酸殘基趨向于“包埋”態(tài)；當(dāng)I850/I830比值為1.25～1.40 時，酪氨酸殘基趨向于“暴露”態(tài)；當(dāng)0.5＜I850/I830＜1.25 時，酪氨酸殘基一部分暴露于蛋白質(zhì)分子表面，一部分包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部?？筛鶕?jù)I850/I830的值計算包埋在分子內(nèi)部和暴露在分子表面的酪氨酸殘基的分子數(shù)N[23]。表3為堿性條件下酪氨酸與色氨酸殘基包埋/暴露情況。由表3可以看出，I850/I830比值在0.5～1.25 范圍內(nèi)，表示酪氨酸殘基一部分暴露于蛋白質(zhì)分子表面，一部分包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。在堿性（pH 7.0～10.0）條件下，隨著pH 值的升高，I850/I830及N暴露∶N包埋的比值均有所下降，表明大豆11S 球蛋白分子中的酪氨酸殘基趨于“包埋”態(tài)。酪氨酸殘基內(nèi)卷于蛋白質(zhì)分子內(nèi)，疏水性氨基酸基團的包埋導(dǎo)致大豆11S 球蛋白H0降低。

760 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，色氨酸拉曼光譜強度（I760）可以反映色氨酸殘基微環(huán)境的極性，色氨酸譜帶的強度越高，表明越多的色氨酸殘基由暴露于分子外部轉(zhuǎn)向包埋于分子內(nèi)部。由表3可以看出，隨著pH 值的升高，大豆11S球蛋白分子內(nèi)的色氨酸殘基拉曼光譜強度逐漸增大，表明處于大豆11S 球蛋白分子外部的色氨酸殘基趨近于“包埋”態(tài)，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)變的更加緊密，這與酪氨酸費米共振I850/I830的分析結(jié)果一致。

表3 堿性條件下酪氨酸與色氨酸殘基包埋/暴露情況Table 3 Embedding/exposure of tyrosine and tryptophan residues at alkaline condition

以上結(jié)果表明，大豆11S 蛋白H0與其疏水性氨基酸殘基的暴露密切相關(guān)。疏水性氨基酸殘基的暴露程度越大，暴露數(shù)量越多，大豆蛋白H0越高。反之，疏水性氨基酸殘基的暴露程度越小，暴露數(shù)量越少，大豆蛋白H0越低?？梢?，大豆蛋白疏水基團的暴露程度是決定其H0強弱的主要原因。

2.3.3 堿性條件下大豆11S 球蛋白二硫鍵分析二硫鍵是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的重要作用力，蛋白質(zhì)拉曼光譜500～550 cm-1是二硫鍵伸縮振動的特征頻率，可以得到大豆11S 球蛋白分子內(nèi)二硫鍵構(gòu)象變化的信息。一般情況下二硫鍵有3 種構(gòu)型，500～510 cm-1附近譜峰歸屬為扭曲-扭曲-扭曲（g-g-g）構(gòu)型，515～525 cm-1附近譜峰歸屬為扭曲-扭曲-反式（g-g-t）構(gòu)型，535～545 cm-1附近譜峰歸屬為反式-扭曲-反式（t-g-t）構(gòu)型[24]。為了研究堿性條件對大豆11S 球蛋白二硫鍵特征拉曼光譜峰強度和位置的影響，采用Peak Analyzer 軟件進行多峰值Guassina 擬合，得到堿性條件下大豆11S 球蛋白二硫鍵構(gòu)型相對含量的變化，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在堿性（pH 7.0～10.0）條件下，大豆11S 球蛋白的二硫鍵構(gòu)型發(fā)生了改變，g-g-g 構(gòu)型相對含量先增加后降低，g-g-t構(gòu)型相對含量先降低后增加，t-g-t 構(gòu)型相對含量總體降低，而堿性pH 處理后大豆11S 球蛋白二硫鍵構(gòu)型的改變呈現(xiàn)出一種非線性的變化趨勢。雖然堿性條件下二硫鍵構(gòu)型未呈規(guī)律性變化，但這種非線性的變化趨勢也證明了在pH 7.0～10.0處理下，大豆11S 球蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，可能發(fā)生蛋白質(zhì)亞基的解離和聚合。

3 結(jié)論

圖4 堿性條件下大豆11S 球蛋白二硫鍵構(gòu)型的變化Fig.4 Change in conformation of disulfide bond of 11S glycinin at alkaline condition

堿性（pH 7.0～12.0）條件下，隨著pH 值的增加，大豆11S 球蛋白的溶解性增加，表面疏水性（H0）降低，Zeta 電位的絕對值增大，平均粒徑整體呈下降趨勢，這表明在堿性條件下，大豆球蛋白表面負電荷增多，更多同性電荷之間的靜電排斥作用使蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定性增強，降低了蛋白質(zhì)之間的聚沉幾率，使蛋白質(zhì)的溶解性增加，同時更多的極性氨基酸暴露于蛋白質(zhì)表面可能會導(dǎo)致H0降低。拉曼光譜分析表明隨著pH 值的升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量降低，蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸殘基趨于“包埋”態(tài)，說明疏水性氨基酸基團的包埋導(dǎo)致大豆11S 球蛋白H0降低。堿性條件下大豆11S 球蛋白的二硫鍵構(gòu)型發(fā)生了改變，證明了在pH 7.0～10.0 處理下，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，可能發(fā)生蛋白質(zhì)亞基的解離和聚合。