田 雨 陳其玲 劉樹文，2，3* 何 玲

（1 西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院 陜西楊凌712100 2 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心 陜西楊凌712100 3 西北農(nóng)林科技大學合陽葡萄試驗示范站 陜西渭南715300 4 西北農(nóng)林科技大學園藝學院 陜西楊凌712100）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵 （Malolactic fermentation，MLF）是提升葡萄酒品質的重要工藝環(huán)節(jié)[1-2]。作為葡萄酒生產(chǎn)中啟動并完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的主要菌種，酒酒球菌應對葡萄酒酒精發(fā)酵結束后高酸、高乙醇含量、高SO2的能力對葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵尤為重要[3-4]。

為了在葡萄酒環(huán)境中生存，膜成分調(diào)整引起的細胞膜流動性調(diào)整是乳酸菌應對脅迫環(huán)境采取的一種機制，此過程中主要是影響膜內(nèi)磷脂和脂肪酸成分[5-7]。環(huán)丙烷脂肪酸（Cyclopropane fatty acid，CFA）是抗脅迫機制中一種重要的膜脂肪酸，CFA 的存在可以降低質子通透性，增強膜的剛性[8-9]。乳酸菌在酸脅迫環(huán)境中會出現(xiàn)不飽和脂肪酸的環(huán)化現(xiàn)象[10-12]。而調(diào)控合成CFA 的環(huán)丙烷脂肪酸合酶（Cyclopropane fatty acid synthesis，CFAS）由環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因 （Cyclopropane fatty acid synthesis gene，cfa）編碼合成。

目前研究發(fā)現(xiàn)酒酒球菌在酸環(huán)境下生長的細胞會增加其CFA 含量以應對環(huán)境的脅迫作用[13-15]。To 和Grandvalet 等[16]在乳酸乳球菌中表達酒酒球菌ATCC BAA 1163 的cfa 基因，其中重組乳酸乳球菌cfa 的基因表達量及CFA 含量在酸性環(huán)境中升高。目前酒酒球菌CFA 相關的研究主要著眼于CFA 在的抗酸機制中的作用，尚無文獻從耐酸性不同的酒酒球菌株間CFAS 的差異這方面探索基因與抗酸性的相關性。

本研究首先通過對野生酒酒球菌進行耐酸性篩選，篩選出耐酸能力很強的野生型酒酒球菌。利用篩選的菌株擴增出cfa 基因進行測序，同時與耐酸、酸敏突變菌進行比對。通過將野生耐酸菌株和酸敏菌株cfa 基因在植物乳桿菌中的表達，對不同耐酸表型菌株株間cfa 基因的差異進行研究，探索環(huán)丙烷脂肪酸基因與菌株抗酸性的相關性及菌株間該基因穩(wěn)定差異造成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

試驗中所用的酒酒球菌菌株保藏于西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，包括篩選自內(nèi)蒙古、山東、陜西、寧夏和河北5 個葡萄酒產(chǎn)區(qū)的34 株酒酒球菌和商業(yè)酒酒球菌31-DH，見表1。耐酸、酸敏突變菌株a3[17]和b2[17]由實驗室離子注入誘變獲得，植物乳桿菌ATCC33222 菌株來源于西北農(nóng)林科技大學食品學院。質粒pMG36e 由江南大學惠贈。

表1 試驗中34 株初篩酒酒球菌的產(chǎn)區(qū)來源Table 1 The regions of thirty four screening strains in the study

1.2 試驗材料與設備

ATB 培養(yǎng)基參照參考文獻[18]，MRS 培養(yǎng)基參照參考文獻[19]，用HCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，試劑均為國產(chǎn)分析純。

PrimeSTAR HS 酶，日本TaKaRa 公司；Ezup柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒、SacI/XbaI 內(nèi)切酶，生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA 膠回收試劑盒，天根科技（北京）有限公司；EZNA 質粒DNA 小量抽提試劑盒，美國OMEGA 公司。

AIR TECH 超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；MJ-250B 培養(yǎng)箱、HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；Thermal Cycler C1000 基因擴增儀，美國Bio-Rad 公司；Agilent Technologies 紫外分光光度計，美國安捷倫科技有限公司；BioTek ELx800 酶標儀，美國博騰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒酒球菌的篩選 將酒酒球菌菌株在pH 4.8 的ATB 培養(yǎng)基中活化2 次至對數(shù)生長期，以4%的接種量接種至pH 2.8 的ATB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24 h 取1.5 mL 菌液于24 孔板中測定其在600 nm 下的吸光度。根據(jù)吸光度的變化情況初步篩選抗酸和酸敏表型差異菌株。將篩選獲得的較耐酸酒酒球菌菌株活化至對數(shù)生長期，以4%接種量接種至pH 2.4，2.6，2.8 的ATB 培養(yǎng)基中，利用紫外分光光度計檢測其在600 nm 下的吸光度，繪制生長曲線。根據(jù)吸光度的變化情況篩選出抗酸能力強的菌株。

1.3.2 目的基因序列的PCR 擴增及序列比對根據(jù)基因序列設計引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為cfa1（TTGAAATGGCAATCGTTTCAGCA ） 和 cfa2 （ CGGTTGTACCGTCGCCTTTA），進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照、分析。將經(jīng)過檢測的PCR 產(chǎn)物送樣測序。將本試驗篩選獲得的耐酸野生菌、酸敏野生菌與本實驗室誘變篩選的耐酸突變菌a3、酸敏突變菌b2[17]的cfa 基因進行序列比對。

1.3.3 酒酒球菌cfa 基因的外源表達 對酒酒球菌cfa 基因的PCR 產(chǎn)物進行切膠回收，具體步驟參照切膠回收試劑盒說明書；利用質粒提取試劑盒進行pMG36e 表達質粒的提取，操作步驟參照說明書。對回收的cfa 基因片段和質粒pMG36e 進行SacI/XbaI 雙酶切，酶切產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳并分別進行切膠回收，獲得目的基因和質粒的酶切產(chǎn)物。將酶切產(chǎn)物連接，反應體系（10 μL）：載體pMG36e（SacI/XbaI）1 μL，目的DNA 片段4 μL，ligation mix 5 μL，16 ℃連接過夜。

植物乳桿菌感受態(tài)細胞制備及電轉方法參照[20]略做調(diào)整。取30 ng 質粒與200 mL 植物乳桿菌感受態(tài)細胞混合后，移入間距為0.2 cm 的電轉杯中，冰上靜置5 min，使用高壓脈沖電轉儀進行電擊轉化，電轉參數(shù)為電壓2.0 kV，電擊常數(shù)4 ms。電擊完畢后，迅速向電轉杯中加入1.8 mL 含0.3 mol/L 蔗糖的MRS 培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)2～3 h，使細胞復蘇。取200 μL 復蘇的菌液，涂布在含200 μg/mL 紅霉素的MRS 平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。將轉化的菌體進行陽性克隆，菌落PCR 鑒定，提取重組質粒后進行雙酶切鑒定。

1.3.4 植物乳桿菌的耐酸性測定 為測定重組植物的耐酸性，耐酸與酸敏野生菌的cfa 基因連接載體并成功導入植物乳桿菌后，將重組的植物乳桿菌接入pH 3.0～4.0 梯度MRS 培養(yǎng)基中測定生長曲線，以含有空載體的植物乳桿菌L0 作為對照。將重組植物乳桿菌菌株在pH 6.5 的MRS 培養(yǎng)基中活化2 次至對數(shù)生長期，以2%的接種量接種至pH 3.0～4.0 梯度MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用紫外分光光度計檢測其在600 nm 下的吸光度，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 酒酒球菌的篩選生長曲線

2.1.1 酒酒球菌菌株初篩 圖1為35 株酒酒球菌在pH 2.8 的ATB 培養(yǎng)基中穩(wěn)定期時利用酶標儀檢測的OD600值。

圖1 酒酒球菌在pH 2.8 環(huán)境下的初篩結果Fig1 The results of the screening Oenococcus oeni in pH 2.8

由圖1可以看出，菌株CS-7b 的生長狀況最好 （OD600值為1.039），SD-2a、ME-5b、ME-2c 和31-DH 菌株的生長狀況較其它菌株存在一定優(yōu)勢（OD600值在0.8～1.0 之間）。其余菌株生長狀況比較相近 （OD600值在0.6 左右）。菌株SD-2d、SX-1b、SD-1b 和ME-2a 的生長情況較差（OD600值低于0.5）。由于試驗中所用的酸敏突變株b2 是由SX-1b 誘變得來，因此確定SX-1b 為野生酸敏酒酒球菌的代表菌株。同時對生長情況較好的CS-7b、SD-2a、ME-5b、ME-2c 和31-DH 這5 株菌進行進一步耐酸能力強的野生菌株的篩選。

2.1.2 酒酒球菌菌株的復篩 以pH 2.8 培養(yǎng)基篩選出的CS-7b、SD-2a、ME-5b、ME-2c 和31-DH 這5 株酒酒球菌利用紫外分光光度計測定其在pH 2.4，2.6，2.8 的ATB 培養(yǎng)基中的生長曲線。圖2為5 株酒酒球菌在pH 2.8 的培養(yǎng)基中的生長曲線。圖3為5 株酒酒球菌在pH 2.6 的培養(yǎng)基中的生長曲線。

由圖2可以看出，CS-7b、SD-2a、ME-5b、ME-2c 和31-DH 這5 株在pH 2.8 培養(yǎng)基中均能存活和生長，CS-7b 和ME-5b 穩(wěn)定期的狀態(tài)（OD600值達到1.8 左右）與酒酒球菌在正常pH 條件下穩(wěn)定期的狀態(tài)基本一致，長勢明顯優(yōu)于SD-2a、ME-2c和31-DH。5 株菌在pH 2.8 培養(yǎng)基中對數(shù)生長期均明顯延長，SD-2a、ME-2c 和31-DH 大約在第5天進入穩(wěn)定期，而CS-7b 和ME-5b 在第7 天進入穩(wěn)定期。結果表明，酒酒球菌菌株在酸性環(huán)境中生長時會出現(xiàn)對數(shù)生長期延長，穩(wěn)定期滯后的現(xiàn)象，符合酒酒球菌適應脅迫環(huán)境的生長趨勢。

圖2 酒酒球菌野生株在pH 2.8 培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curve of wild O.oeni cultured in ATB medium （pH 2.8）

由圖3看出，CS-7b 和ME-5b 在pH 2.6 培養(yǎng)基中存活能力明顯高于其余3 株菌 （穩(wěn)定期OD600值0.3～0.35 之間），生長曲線趨勢也比較符合細菌生長周期。其余3 株菌生長曲線基本沒有變化，確定菌體沒有生長。CS-7b 和ME-5b 兩株菌有更為明顯的耐酸優(yōu)勢。在pH 2.4 環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)、篩選和確認時發(fā)現(xiàn)5 株菌均沒有生長。

CS-7b 和ME-5b 的耐酸能力相似，菌株的耐酸極限是pH 2.6，結果確定了CS-7b 和ME-5b為研究中所篩選的36 株野生酒酒球菌中最耐酸的菌株。經(jīng)過對36 株野生酒酒球菌的初篩、復篩及綜合比較發(fā)現(xiàn)，最終確定用于研究的耐酸和酸敏菌株均為陜西省篩選的野生酒酒球菌及其誘變株，一定程度上保證了遺傳背景的相似性。

2.2 環(huán)丙烷脂肪酸合酶基因的PCR 和序列分析

以提取的酒酒球菌全基因組為模板，以1.3.2節(jié)中的兩對特異性引物進行PCR 擴增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并送樣測序。

圖3 酒酒球菌野生株在pH 2.6 培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curve of wild O.oeni cultured in ATB medium （pH 2.6）

測序結果提交Genebank 核酸數(shù)據(jù)庫，菌株ME-5b、CS-7b、a3、b2 的cfa 基因訪問號依次為KX467881、KX467882、KX467883、KX467884。對擴增cfa 基因的測序結果顯示，該基因全長1 188 bp，含有完整的開放閱讀框，編碼395 個氨基酸，測序結果顯示酸敏野生菌和突變菌與PSU-1 菌株該基因的堿基序列完全一致，而耐酸野生株和突變菌均在684（C-T）、898（A-C）和924（A-G）處發(fā)生突變。將所得核苷酸序列推導的氨基酸序列與PSU-1 標準菌株中對應氨基酸序列進行比對，結果如圖4所示。耐酸菌株該基因編碼的氨基酸序列與標準菌株同源性達99%以上，3 個堿基突變中有一個為非同義突變，第300 個氨基酸由I（異亮氨酸）突變?yōu)長（亮氨酸）。

2.3 重組植物乳桿菌表達載體的構建

在耐酸野生菌CS-7b 和ME-5b 中，選擇篩菌過程中生長較穩(wěn)定的CS-7b 作為耐酸菌中cfa 基因的來源。酸敏野生菌SX-1b 作為酸敏菌cfa 基因的來源。將SX-1b 和CS-7b 中擴增的cfa 基因和載體進行酶切、連接和轉化。菌落PCR 驗證后，分別獲得重組菌L1 和L2，提取重組質粒進行雙酶切驗證。驗證結果見圖5。重組質粒經(jīng)過SacI/XbaI 雙酶切后，釋放約3 610 bp 和1 188 bp 大小的片段，分別對應pMG36e 和cfa 基因的大小，與圖5的驗證結果一致，說明重組質粒構建成功，獲得研究所需要的重組植物乳桿菌。

2.4 重組植物乳桿菌的耐酸性變化

圖4 耐酸、酸敏菌株與對照菌株PSU-1 中OEOE_RS05660 基因編碼的氨基酸序列比對結果Fig.4 Alignment of the deduced amino acid sequence coded by gene OEOE_RS05660 from acid-resistant/acid-sensitive strains and Oenococcus oeni PSU-1

圖5 pMG36e-cfa1/2 的酶切結果Fig.5 Identification of pMG36e-cfa1/2 by enzyme digestion

將對照重組植物乳桿菌L0 分別在pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結果表明L0 在pH 3.0 下沒有生長，在pH 4.0，5.0，6.0，7.0 中生長良好，因此確定在pH 3.0～4.0 梯度培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組植物乳桿菌及對照菌。圖6為在pH 3.6 及pH 3.4 培養(yǎng)基中3 株菌的生長曲線圖，pH 3.2 培養(yǎng)基中3 株菌均沒有生長。L2 和L1 的生長極限在pH 3.4，相較于L0 的極限值出現(xiàn)突破，cfa 基因的導入使植物乳桿菌耐酸性明顯升高。同時，在pH 3.6 培養(yǎng)基中，L2 和L1 的穩(wěn)定期OD600值相較于L0 分別增加了約42%和33%，菌體生長的漲幅L2>L1；在pH 3.4 培養(yǎng)基中，L2 的生長情況也優(yōu)于L1，說明一定程度上L2 在適應酸脅迫環(huán)境方面有一定的優(yōu)勢。

綜合兩株重組菌和對照菌生長情況的測定，結果表明，酒酒球菌cfa 基因的外源插入對于植物乳桿菌在酸性環(huán)境中的表現(xiàn)有明顯提升，并突破對照菌的生長極限。同時提升程度與cfa 來源的酒酒球菌的耐酸性一致；酒酒球菌耐酸性越好，對應cfa基因的重組植物乳桿菌在酸性環(huán)境中生長的越好。

圖6 重組植物乳桿菌在pH 3.6，3.4 MRS 培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant L.plan cultured in MRS medium （pH 3.6，3.4）

3 結論

為研究不同耐酸表型的酒酒球菌cfa 基因的株間差異，同時進一步研究酒酒球菌CFA 在抗酸機制中的作用，本研究利用篩選自國內(nèi)5 個產(chǎn)區(qū)的35 株野生酒酒球菌進行耐酸菌株的篩選，最終篩選出2 株可以在pH 2.6 培養(yǎng)基中生長的耐酸野生菌株CS-7b 和ME-5b。在對cfa 基因的測序比對中，將實驗室誘變篩選獲得的耐酸突變株和酸敏突變株加入比對，證明cfa 堿基突變與菌株耐酸能力具有相關性。將野生酸敏、耐酸菌株SX-1b和CS-7b 的cfa 基因在植物乳桿菌中表達，研究重組植物乳桿菌的耐酸能力變化。結果發(fā)現(xiàn)重組菌突破了原菌的生長極限，進一步證明cfa 與菌株耐酸能力具有相關性，且cfa 基因存在的堿基突變使重組菌株在耐酸能力方面存在差異。

研究中篩選的耐酸野生酒酒球菌可以作為研究酒酒球菌耐酸能力和作用機制的菌種資源，同時耐酸菌株具有較低的生長極限pH 以及在酸性培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長的特性為葡萄酒生產(chǎn)中實現(xiàn)高酸原料啟動和完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵提供了可能。然而耐酸菌株是在培養(yǎng)基中進行篩選，pH 值為唯一的脅迫條件。由于酒精發(fā)酵結束葡萄酒中復雜的生存環(huán)境和多種脅迫條件，菌株能否存活并順利啟動，并完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵，以及對葡萄酒風味的具體影響還有待進一步研究。

研究中成功構建重組菌可以進一步研究其發(fā)酵蘋果酸的能力和在其它脅迫因素下的耐受性，為植物乳桿菌工程菌在葡萄酒生產(chǎn)中作為發(fā)酵啟動劑提供一定基礎。由于酒酒球菌的耐酸性由多基因共同作用[21-22]，cfa 基因及其株間出現(xiàn)的堿基突變在抗酸機制中發(fā)揮作用的機理需要進一步研究。

酒酒球菌很難導入外源質粒實現(xiàn)高效表達和基因敲除[3]，因此本試驗中所用的方法和思路也可以為酒酒球菌中其它可能與耐酸能力甚至抗脅迫能力相關的基因的研究提供參考。同時也證明在研究酒酒球菌抗脅迫基因過程中，基因在株間的差異是不容忽略的因素。