江艷華 顧曉慧，3 郭瑩瑩 朱文嘉 姚 琳 劉占濤 高 華 王聯(lián)珠*

（1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室山東青島266071 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山東青島266021 3 威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系 山東威海264300）

紫菜（Pyropia），屬于紅藻綱、紅毛菜科，是世界重要的經(jīng)濟藻類之一。我國的紫菜產(chǎn)量位居世界第一，2018年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到20.18 萬t，其中主要品種有條斑紫菜 （P.yezoensis） 和壇紫菜（P.haitanensis）[1]。條斑紫菜是國際貿(mào)易流通的主要品種，在亞洲尤其在我國、日本和韓國有大規(guī)模養(yǎng)殖，我國的主產(chǎn)區(qū)為江蘇省，是出口的主要品種。壇紫菜是我國特有的養(yǎng)殖品種，主產(chǎn)區(qū)為浙江和福建省，約占我國紫菜總產(chǎn)量的75%，占世界紫菜產(chǎn)量的50%以上[2]。紫菜富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、不飽和脂肪酸、維生素、微量元素等，具有很高的營養(yǎng)價值，還具有抗氧化，抗腫瘤，抗衰老，免疫調(diào)節(jié)等功效，在食品、藥品及化妝品等方面具有巨大的開發(fā)利用價值[3-5]。

近年來，紫菜的安全性受到社會各界的廣泛關(guān)注，其中重金屬超標(biāo)問題尤為嚴(yán)重。紫菜由于特殊的生理特性及生活環(huán)境，極易富集水體中的重金屬，造成藻體中重金屬含量較高，因重金屬超標(biāo)造成產(chǎn)品不合格，給很多企業(yè)帶來困擾[6]。然而，關(guān)于紫菜重金屬的安全性仍然沒有定論，國外也未對紫菜的重金屬限量進(jìn)行規(guī)定。2011年7月召開的第35 屆國際食品法典委員會（Codex alimentarius commission，CAC）年會作出了以韓國為主，中、日、韓三國共同制定CAC《紫菜產(chǎn)品區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)》的決定，紫菜的質(zhì)量安全進(jìn)一步引起政府部門的高度關(guān)注[2]。目前，該標(biāo)準(zhǔn)已發(fā)布，雖然未對重金屬限量做出規(guī)定，但在標(biāo)準(zhǔn)制定過程中一直存在很大爭議?；谶@些背景，本文采用30 d 喂養(yǎng)試驗，探討條斑紫菜和壇紫菜對大鼠體質(zhì)量、肝腎功能和抗氧化系統(tǒng)的影響，并以鉛為例，探討紫菜中的鉛在各器官組織中的蓄積情況，為紫菜的食用安全性評估提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

條斑紫菜采集自江蘇連云港，壇紫菜采集自福建晉江。紫菜經(jīng)80 ℃烘干至恒重，過80 目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆谩嶒炃皩⒆喜巳苡谖鼽S蓍膠助懸劑中，分別制成50，30，10 mg/mL 的混懸液。

Wistar 大鼠，清潔級，體質(zhì)量（220±20）g，雌雄各半，山東省魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

西黃蓍膠、硝酸、高氯酸、乙酸鉛（Pb（CH3COO）2·3H2O），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；烏拉坦，北京普博斯生物科技有限公司；鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；總蛋白（TP）檢測試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（二乙醇胺法）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測試劑盒、尿素氮（BUN） 檢測試劑盒、肌酐（Cr）檢測試劑盒，德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全譜直讀等離子體發(fā)射光譜儀Optima 5300DV，美國PerkinElmer 公司；多功能快速消化器LNK-872，江蘇宜興科教儀器研究所；紫外可見分光光度計UV-3600，日本島津公司；全自動生化分析儀CS-800B，長春迪瑞實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物實驗 大鼠運送至實驗室后進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，觀察無異常情況后按體質(zhì)量隨機分為7 組，每組8 只，雌雄各半，分別記為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G 組。其中A 組為空白對照組（生理鹽水），B 組為條斑紫菜高劑量組【500 mg/（kg bw·d）】，C 組為條斑紫菜中劑量組【300 mg/（kg bw·d）】、D 組為條斑紫菜低劑量組【100 mg/（kg bw·d）】，E 組為壇紫菜高劑量組【500 mg/（kg bw·d）】，F(xiàn) 組為壇紫菜中劑量組【300 mg/（kg bw·d）】、G 組為壇紫菜低劑量組【100 mg/（kg bw·d）】。實驗組（B～G 組）大鼠除了正常進(jìn)食飼料及飲水外，每天灌胃紫菜樣品，連續(xù)灌胃30 d，空白對照（A 組）灌胃等體積的生理鹽水。實驗期間，每天觀察和記錄大鼠一般表現(xiàn)、行為、中毒或死亡情況，每周對大鼠稱重一次，以調(diào)整灌胃量。所有實驗動物進(jìn)食低鉛飼料（實測鉛含量小于0.003 mg/kg），飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，人工晝夜為12 h/12 h。

灌胃30 d 后，稱取體質(zhì)量，對大鼠禁食（不禁水）12 h，以4 mL/kg bw 的劑量注射25%烏拉坦麻醉大鼠，由腹主動脈取血，一部分用于測定全血的鉛含量，一部分用于分離血清。將用于分離血清的血液在室溫下靜置1～2 h，于4 ℃下3 000 r/min 離心15 min，分離血清，用于生化指標(biāo)的測定。摘取大鼠肝臟和腎臟，稱重，收集糞便并凍干，所有樣品及時置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生化指標(biāo)測定 采用商品化試劑盒測定血清中的SOD 和GSH-Px 的活力。采用商品化試劑盒結(jié)合生化分析儀測定血清中的肝功能指標(biāo)TP、ALP、AST、ALT 以及腎功能指標(biāo)BUN、Cr 的含量（或活力）。

1.3.3 鉛含量的測定 采用硝酸和高氯酸對大鼠肝、腎、血液、糞便樣品進(jìn)行濕法消化，用全譜直讀等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-AES）進(jìn)行測定[7]。儀器測定波長：220.353 nm；觀測方式：軸向；射頻功率：1 300 W；觀測高度：工作線圈以上15.0 mm；等離子氣流量（氬氣）：15 L/min；輔助氣流量（氬氣）：0.2 L/min；霧化器流量（氬氣）：0.8 L/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

大鼠體質(zhì)量增長率=（大鼠最終體質(zhì)量-大鼠初始體質(zhì)量）/大鼠初始體質(zhì)量×100%。肝（腎）的相對質(zhì)量= 肝（腎）質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0 進(jìn)行分析，結(jié)果以8 只大鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)比較采用t-檢驗法，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.01 表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜對大鼠體質(zhì)量及臟器質(zhì)量的影響

條斑紫菜和壇紫菜對大鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果見表1。在灌胃實驗期間，在第14 天時壇紫菜處理組的大鼠體質(zhì)量增長率與空白對照組持平，其余時間點下條斑紫菜和壇紫菜處理組的大鼠體質(zhì)量增長率均高于空白對照組，表明紫菜能促進(jìn)大鼠生長，然而各組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明紫菜對大鼠生長發(fā)育沒有顯著影響。

2.2 紫菜對大鼠肝腎質(zhì)量及肝腎系數(shù)的影響

紫菜對大鼠肝腎質(zhì)量及肝腎系數(shù)的影響結(jié)果見表2，喂養(yǎng)條斑紫菜和壇紫菜的各組大鼠的肝腎絕對質(zhì)量和肝腎系數(shù)均與空白對照組無顯著性差異（P＞0.05），說明條斑紫菜和壇紫菜對肝腎質(zhì)量和肝腎系數(shù)無影響。

表1 紫菜對大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effects of laver on body mass of rats

表2 紫菜對大鼠肝腎質(zhì)量及肝腎系數(shù)的影響Table 2 Effects of laver on liver and kidney mass and their coefficients of rats

2.3 紫菜對大鼠肝功能的影響

紫菜對大鼠肝功能指標(biāo)TP、ALP、AST 和ALT的影響結(jié)果如表3所示，喂食條斑紫菜和壇紫菜的大鼠，各項肝臟生化指標(biāo)與空白對照組之間無顯著性差異（P>0.05），說明在生理生化水平上紫菜能夠維持肝臟的正常功能。

表3 紫菜對大鼠肝功能的影響Table 3 Effects of laver on liver function of rats

2.4 紫菜對大鼠腎功能的影響

紫菜對大鼠腎功能指標(biāo)BUN 和Cr 的影響結(jié)果見表4，各紫菜劑量組的BUN 含量和Cr 含量與空白對照組間均未呈現(xiàn)顯著性差異 （P>0.05），各劑量組間無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果表明紫菜能夠在生理生化水平上維持大鼠正常的腎臟功能。

2.5 紫菜對大鼠抗氧化系統(tǒng)的影響

SOD 和GSH-Px 是機體抗氧化損傷防御體系中最重要的兩種抗氧化酶。結(jié)果如表5所示，所有劑量的壇紫菜均能顯著提高大鼠SOD 的活力（P＜0.05），中劑量和高劑量的壇紫菜能極顯著提高大鼠GSH-Px 的活力（P＜0.01），壇紫菜攝入量越高，SOD、GSH-Px 的活力越高，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。條斑紫菜處理后，大鼠的SOD 和GSH-Px活力略有升高，而變化不顯著（P＞0.05）。

表4 紫菜對大鼠腎功能的影響Table 4 Effects of laver on renal function of rats

表5 紫菜對大鼠抗氧化系統(tǒng)的影響Table 5 Effects of laver on antioxidant defense system of rats

2.6 紫菜對大鼠體內(nèi)鉛含量的影響

經(jīng)過測定，本試驗用的條斑紫菜和壇紫菜樣品中鉛含量分別為1.332 mg/kg 和2.451 mg/kg。以含鉛的紫菜喂食大鼠后，大鼠體內(nèi)肝腎、血液及糞便中鉛含量的變化見表6。結(jié)果顯示，大鼠肝臟和腎臟的鉛含量并未受到紫菜的影響，各劑量組與空白對照組間無顯著性差異（P＞0.05），表明紫菜中的鉛并未在大鼠肝臟和腎臟中蓄積。條斑紫菜低劑量組和壇紫菜高、中、低劑量組中大鼠的血鉛含量顯著高于空白對照組（P＜0.01），條斑紫菜高、中、低劑量組中大鼠的糞鉛含量顯著高于空白對照組（P＜0.01）。從血液和糞便中鉛含量的數(shù)值來看，當(dāng)糞便中鉛含量高時，對應(yīng)的血液中鉛含量則較低，表明條斑紫菜中的鉛更易隨糞便排出動物體外，減少在體內(nèi)的蓄積。

3 討論

本研究以條斑紫菜和壇紫菜為研究對象，基于中國人均體重60 kg、人均每日紫菜攝入量2～10 張（或6～30 g）的量，設(shè)置3 個劑量，分別為500，300，100 mg/（kg bw·d），進(jìn)行30 d 喂養(yǎng)實驗。通過對大鼠的生長情況、肝腎功能、抗氧化系統(tǒng)功能以及各組織和糞便中鉛含量等指標(biāo)的測定，初步探討紫菜的食用價值及安全性。

實驗期間，各組大鼠發(fā)育良好，被毛濃密有光澤，活動正常、較活躍，均未出現(xiàn)死亡和異?，F(xiàn)象。體重是反映生物體健康狀況的一項重要指標(biāo)，實驗期間各劑量組大鼠的體質(zhì)量呈逐漸增長的趨勢，灌胃條斑紫菜和壇紫菜的大鼠體質(zhì)量增長更快，盡管與空白對照組無顯著性差異，還是反應(yīng)出紫菜的促生長作用。條斑紫菜和壇紫菜含有豐富的氨基酸，必需氨基酸含量高達(dá)40%左右，其組成比例與世界糧農(nóng)組織（FAO）發(fā)布的人類必需氨基酸的理想模式相似，同時富含各種維生素、膽堿、鈣和鐵等微量元素，因而能夠促進(jìn)生物體的生長和發(fā)育[8]。

表6 紫菜對大鼠體內(nèi)鉛含量的影響Table 6 Effects of laver on content of lead in organs of rats

當(dāng)食物經(jīng)過消化道進(jìn)入人體后，通過血液輸送到機體各個組織，肝臟和腎臟是生物體進(jìn)行物質(zhì)代謝和毒物蓄積的重要器官。如果攝入的食物中含有有毒物質(zhì)，肝臟和腎臟就有可能出現(xiàn)不同程度的損傷，肝腎損傷可能引起細(xì)胞腫脹、增生，使臟器系數(shù)增高，也可因肝腎細(xì)胞壞死吸收，血液供應(yīng)減少，導(dǎo)致肝腎萎縮，使臟器系數(shù)降低[9]。當(dāng)肝功能受損，出現(xiàn)代謝紊亂，肝臟中各種酶類大量溢出進(jìn)入血液，使血清中酶活性升高，這些酶主要包括TP、ALP、AST 和ALT 等，是診斷肝臟損傷的主要監(jiān)測指標(biāo)[10]。當(dāng)腎臟功能受損，機體內(nèi)含氮化合物的代謝水平受到影響，導(dǎo)致體內(nèi)BUN 和Cr 濃度升高[11]。本實驗對大鼠喂食紫菜后，大鼠的肝臟、腎臟質(zhì)量以及肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、肝腎功能指示指標(biāo)等與空白對照無顯著性差異，也無明顯的量效關(guān)系，解剖時，各組大鼠內(nèi)臟等均未發(fā)現(xiàn)異常，表明紫菜對大鼠沒有明顯毒性作用。

當(dāng)有毒物質(zhì)進(jìn)入機體，在代謝過程中會產(chǎn)生自由基，如超氧陰離子、羥基、過氧化氫等，造成機體的脂質(zhì)氧化和一些重要酶類的氧化，從而導(dǎo)致機體損傷[12]?？寡趸甘菣C體對抗氧化損傷的第一道防線，SOD 和GSH-Px 是機體重要的兩種抗氧化酶，SOD 能清除超氧陰離子，GSH-Px 能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進(jìn)H2O2分解，從而保護細(xì)胞免受損傷[13-14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，壇紫菜能顯著提高大鼠SOD 和GSH-Px 的活力，且與攝入紫菜呈量效關(guān)系，表明壇紫菜具有顯著提高生物體抗氧化防御能力。

紫菜由于特殊的生理特性及生活環(huán)境，極易富集水體中的重金屬，造成藻體中重金屬含量較高。我國GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定藻類中鉛最高限量為1.0 mg/kg （以干重計）[15]，依據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)，紫菜產(chǎn)品的鉛含量極易超標(biāo)，造成產(chǎn)品下架，給很多企業(yè)帶來困擾。目前CAC、日本、韓國、美國、歐盟均未對紫菜中鉛的限量進(jìn)行規(guī)定，在制定CAC《紫菜產(chǎn)品區(qū)域標(biāo)準(zhǔn)》時，日本也認(rèn)為不必要規(guī)定重金屬限量，而我國規(guī)定紫菜等藻類的鉛限量為1.0 mg/kg，該限量是否過于嚴(yán)格需要進(jìn)行科學(xué)地評估。

本實驗的條斑紫菜和壇紫菜樣品鉛含量分別為1.332 mg/kg 和2.451 mg/kg，該數(shù)值已經(jīng)超過我國GB 2762-2017 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的相關(guān)規(guī)定。鉛是一種蓄積性極強的污染物，主要通過消化道和呼吸道進(jìn)入生物體，經(jīng)口攝入的鉛主要分布在血液、腎臟和肝臟中，較長時間的染毒會于骨骼蓄積，從而破壞器官和組織正常結(jié)構(gòu)和生理功能。張建平等[16]采用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)鉛在大鼠體內(nèi)主要蓄積在肝腎中。在本實驗中，大鼠肝臟和腎臟的鉛含量并未受到紫菜的影響，表明紫菜中的鉛并未在大鼠肝臟和腎臟中蓄積。而大鼠血液中的鉛含量與糞便中鉛含量呈一定反比關(guān)系，當(dāng)糞便中鉛含量高時，對應(yīng)的血液中鉛含量則較低，其中條斑紫菜中的鉛更易隨糞便排出動物體外。紫菜含有活性多糖等物質(zhì)，表面含有較多的活性基團且?guī)в幸欢ǖ呢?fù)電荷，對重金屬具有較強的吸附作用[6]，雖然紫菜中的鉛含量較高，但是進(jìn)入機體后，鉛有可能隨著紫菜的螯合作用最后排出體外，并未在體內(nèi)造成蓄積。盡管本實驗發(fā)現(xiàn)攝入壇紫菜的大鼠血液中鉛含量明顯高于空白對照組，但這并不能表明壇紫菜中的鉛具有毒性作用，從實驗結(jié)果來看，壇紫菜并未造成大鼠中毒效應(yīng)，而且從抗氧化作用來看，壇紫菜能提高大鼠機體的抗氧化防御功能，這在抵御重金屬中毒效應(yīng)中具有重要意義。

1993年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）推薦的人體每周可耐受鉛攝入量（PTWIs） 為0.025 mg/kg bw[17]，則我國成年人按60 kg 標(biāo)準(zhǔn)體重計算每天可耐受攝入量為0.214 mg。雖然因各國實際鉛攝入量達(dá)到引起兒童智商損害和成人收縮壓升高的程度，JECFA 取消了PTWIs 值[18]，但目前很多文獻(xiàn)仍以該值作為評估的重要依據(jù)。本實驗用的紫菜樣品按人均每日攝入量6～30 g 計，則從條斑紫菜攝入的鉛為0.008～0.040 mg，占可耐受攝入量的3.74%～18.69%；從壇紫菜攝入的鉛為0.015～0.074 mg，占可耐受攝入量的7.01%～34.58%。雖然缺少紫菜的膳食調(diào)查數(shù)據(jù)，但根據(jù)我國人群的飲食習(xí)慣，紫菜在消費食物中的占比很小，人均每日攝入量要遠(yuǎn)低于6 g，從紫菜攝入的鉛僅占可耐受攝入量的極小部分，可以說是比較安全的。

綜上所述，本研究以條斑紫菜和壇紫菜為研究對象，從動物實驗的角度出發(fā)對其食用安全性進(jìn)行了初步評價，結(jié)果表明紫菜能夠維持大鼠正常的生理機能，尤其是壇紫菜能夠明顯增強抗氧化能力，對生物體健康具有良好的功效，紫菜中的鉛未在肝腎等靶器官中蓄積。至于紫菜中重金屬的安全性則需要通過分離和鑒定紫菜中不同形態(tài)和不同結(jié)合態(tài)重金屬的毒性來做進(jìn)一步科學(xué)評估。