方昱 張慶斌 許恩文 范新俊 孫麗娜 成威

(安徽省第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230041)

心肌細胞凋亡貫穿于心血管疾病發(fā)生發(fā)展的整個過程〔1〕，抑制心肌細胞的凋亡對于心血管疾病的治療具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1是一種可對細胞生長進行調(diào)控的細胞因子，參與細胞增殖凋亡、免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)生等過程，目前已有多項研究表明TGF-β1可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡〔2，3〕，TAGLN2是鈣結(jié)合蛋白calponin家族的一個成員，與細胞的遷移、分化、組織浸潤及胞外基質(zhì)重塑等生物學行為存在密切關(guān)系，近些年已證實在膀胱癌、食管癌等多種腫瘤中TAGLN2呈高表達，其表達可影響細胞增殖、遷移和侵襲等〔4，5〕。TAGLN2在心血管方面的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，TAGLN2在心肌梗死心力衰竭大鼠心肌組織中表達升高，miR-133a可通過抑制TAGLN2降低心肌細胞凋亡〔6〕，但TAGLN2對心肌細胞凋亡的機制研究尚未明確。本研究通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制TAGLN2表達，觀察TAGLN2表達抑制后對TGF-β1誘導(dǎo)H9c2心肌細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。TGF-β1、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針均購自美國Sigma；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；TAGLN2、p53、裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)3、B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、核因子(NF)-κB p65和IκB-α抗體均購自美國CST；流式細胞儀購自美國BD。

1.2 細胞培養(yǎng) H9c2心肌細胞在DMEM培養(yǎng)基〔含10%胎牛血清(FBS)、青鏈霉素雙抗及200 mmol/L L-谷氨酰胺〕中，于37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞達80%生長匯合度時傳代。將生長至對數(shù)期的細胞制備成單細胞懸液。

1.3 分組及轉(zhuǎn)染 H9c2心肌細胞分為空白對照組、NC組、TGF-β1組和TGF-β1+si-TAGLN2組?？瞻讓φ战M細胞不經(jīng)特殊處理，NC組轉(zhuǎn)染無干擾作用的陰性對照siRNA，TGF-β1組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA后用20 ng/ml TGF-β1處理24 h，TGF-β1+si-TAGLN2組轉(zhuǎn)染靶向抑制TAGLN2表達的siRNA后用20 ng/ml TGF-β1處理24 h。siRNA的轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000(美國，Invitrogen)說明，轉(zhuǎn)染前1 d以3.6×105個/孔密度接種H9c2心肌細胞于6孔板，細胞達80%～90%生長密度時將制備的siRNA-Lipo2000混合物轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞。

1.4 Western印跡 適量放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜2 h，洗膜，加入均按照1∶1 000稀釋好的TAGLN2、p53、 Cleaved caspase3、Bcl-2、PI3K、 p-AKT、NF-κB p65和IκB-α抗體，4℃搖床孵育過夜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育1.5 h，電化學發(fā)光(ECL)顯色。GAPDH作為內(nèi)參蛋白，通過Quantity軟件分析各蛋白條帶灰度值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值為各蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5 細胞凋亡檢測 收集各處理至規(guī)定時間的細胞，制備成105/ml濃度的單細胞懸液，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，1倍結(jié)合緩沖液500 μl重懸細胞，分別加入AnnexinV-FITC 5 μl和PI 10 μl，充分混勻，避光室溫反應(yīng)20 min，上機前再加入300 μl 1倍結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.6 細胞活性氧(ROS)水平檢測 收集各處理至規(guī)定時間的細胞，將細胞懸浮在含終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA無血清培養(yǎng)液中，37℃孵育20 min，流式細胞儀檢測DCF的熒光強度。由于ROS探針DCFH-DA無熒光，但可以穿過細胞膜將無熒光的DCFH氧化為帶有熒光的DCF，因此對DCF的熒光強度檢測可以間接反映細胞內(nèi)ROS水平。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 si-TAGLN2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞效果 3組TAGLN2蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=69.560，P=0.000)。si-TAGLN2組TAGLN2表達(0.066±0.009)顯著低于空白對照組(0.368±0.044，P<0.05)，而NC組(0.389±0.047)與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 si-TAGLN2轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞效果

2.2 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞凋亡的影響 3組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(F=140.871，P=0.000)。TGF-β1組細胞凋亡率(31.11%±3.26%)顯著高于NC組(3.86%±0.32%，P<0.05)，TGF-β1+si-TAGLN2組(12.24%±1.31%)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)。見圖2。

圖2 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞凋亡的影響

2.3 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 與NC組比較，TGF-β1組細胞Bcl-2蛋白表達顯著降低，Cleaved caspase3和p53蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+si-TAGLN2組Bcl-2蛋白表達顯著升高，Cleaved caspase3和p53蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3，表1。

圖3 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

組別Bcl-2Cleaved caspase3p53NC組0.524±0.0480.048±0.0070.104±0.010TGF-β1組0.113±0.0121)0.197±0.0231)0.678±0.0651)TGF-β1+si-TAGLN2組0.305±0.0342)0.066±0.0092)0.155±0.0162)F值105.61090.332198.299P值0.0000.0000.000

與NC組比較：1)P<0.05；與TGF-β1組比較：2)P<0.05；下表同

2.4 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞ROS水平的影響 TGF-β1組細胞ROS水平(DCF熒光強度：67.74±3.22)顯著高于NC組(25.65±1.83，P<0.05)，而TGF-β1+si-TAGLN2組(39.67±2.51)顯著低于TGF-β1組(P<0.05)，且3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=206.524，P=0.000)。

2.5 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞PI3K/AKT及NF-κB信號的影響 與NC組比較，TGF-β1組細胞PI3K、 p-AKT和IκB-α蛋白表達顯著降低，NF-κB p65蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與TGF-β1組比較，TGF-β1+si-TAGLN2組PI3K、 p-AKT和IκB-α蛋白表達顯著升高，NF-κB p65蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖4，表2。

圖4 si-TAGLN2對H9c2心肌細胞PI3K/AKT及NF-κB信號的影響

表2 各組PI3K、 p-AKT、NF-κB p65和IκB-α蛋白表達比較

3 討 論

細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程，異常的細胞凋亡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。心肌細胞的凋亡是心肌病中心肌細胞死亡的形式之一，其凋亡貫穿于心血管疾病發(fā)生發(fā)展的整個過程。TGF-β1是一種多功能的細胞因子，在心肌梗死、心肌肥厚等心血管疾病中急劇增加，一些轉(zhuǎn)錄激活因子也可上調(diào)TGF-β1在大鼠心肌細胞的表達，而TGF-β1的分泌又可作用于心肌細胞自身，通過調(diào)控一些信號通路誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡〔7，8〕。已有多項研究表明心肌細胞在TGF-β1的刺激下可發(fā)生凋亡〔2，3〕。TAGLN是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，主要在平滑肌細胞中存在，在維持細胞運動、調(diào)節(jié)細胞骨架等過程中有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a可通過靶向抑制TAGLN2介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡〔9〕。由于RNAi技術(shù)是一種可在轉(zhuǎn)錄后阻斷目的基因表達的新技術(shù)，在基因功能研究、疾病治療等方面應(yīng)用廣泛〔10〕，本研究中使用RNAi技術(shù)抑制H9c2心肌細胞TAGLN2表達，發(fā)現(xiàn)TAGLN2表達的抑制可明顯降低由TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

細胞凋亡受分子水平調(diào)控，Bcl-2家族、caspase家族及p53在細胞凋亡過程中均發(fā)揮重要作用。研究表明，多種心血管疾病中Bcl-2的表達下調(diào)，caspase3、p53表達上調(diào)，從而可引起心肌細胞凋亡，而上調(diào)Bcl-2表達及下調(diào)caspase3和p53表達可對心肌細胞凋亡起抑制作用〔11，12〕。本研究結(jié)果表明，TAGLN2表達的抑制對心肌細胞凋亡的調(diào)節(jié)方式是上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Cleaved caspase3和p53表達。心肌細胞的凋亡還受PI3K/AKT、NF-κB信號的調(diào)控，PI3K/AKT信號是細胞內(nèi)一條重要的信號途徑，在細胞內(nèi)發(fā)揮促細胞生存、抗凋亡等功能。研究表明，激活PI3K/AKT信號對多種因素誘導(dǎo)的心肌細胞損傷起保護作用〔13，14〕。NF-κB幾乎存在于所有的真核細胞中，對細胞凋亡具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，在多種心血管病中，NF-κB信號被激活，抑制心肌NF-κB活性及IκB-α降解可減少心肌細胞凋亡〔15，16〕。本研究結(jié)果表明，TAGLN2表達的抑制可通過激活PI3K/AKT信號及抑制NF-κB信號降低TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。此外，氧化應(yīng)激(OS)也已被證實可誘導(dǎo)多種培養(yǎng)的細胞發(fā)生凋亡，也被認為是多種細胞凋亡的共同介質(zhì)，OS產(chǎn)生的ROS可作用于信號分子而介導(dǎo)細胞凋亡〔17，18〕。研究表明，在TGF-β1、高糖等誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡過程中ROS水平升高，可介導(dǎo)心肌細胞凋亡〔19，20〕。

綜上，TAGLN2表達的抑制可降低心肌細胞凋亡，機制可能與降低細胞內(nèi)ROS水平、激活PI3K/AKT信號和抑制NF-κB信號有關(guān)，對凋亡的作用方式是上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Cleaved caspase3和p53表達。