周穎 趙敏 李桃 陳艷昕 黃江梅

(秦皇島市第一醫(yī)院病理科，河北 秦皇島 066000)

脫氫表雄酮(DHEA)是人體內(nèi)最豐富的來源于腎上腺的甾體激素。研究顯示DHEA有抗動脈粥樣硬化(AS)作用〔1,2〕，但其機(jī)制尚不清楚。血小板源生長因子(PDGF)具有趨化作用，是AS發(fā)生發(fā)展過程中的主要因子〔3～5〕。本研究擬觀察DHEA對高脂誘導(dǎo)的兔主動脈及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)PDGF表達(dá)的影響，同時觀察過表達(dá)細(xì)胞色素P450芳香酶基因(CYP19)能否增強(qiáng)DHEA的抗AS作用，從而探討DHEA抗AS的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 用胰酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，并傳代。將生長良好的HUVEC更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后隨機(jī)分成6組：①正常對照組無血清培養(yǎng)基；②氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)組無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL；③ox-LDL+DHEA(低濃度)組無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL+0.1 μmol/L DHEA(Fluka公司)；④ox-LDL+DHEA(高濃度)組無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA；⑤ox-LDL+DHEA+全反式維甲酸(ATRA)組無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA+0.01 μmol/L ATRA；⑥D(zhuǎn)HEA組無血清培養(yǎng)基+1.0 μmol/L DHEA。24 h后收集細(xì)胞及上清液。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測HUVEC PDGF mRNA的表達(dá) 按Trizol(Invitrogen公司)試劑盒說明書分別提取各組HUVEC總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s， 68℃ 20 s，40個循環(huán)。GAPDH基因為內(nèi)參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。PCR引物由Gene Copoeia 公司合成，PDGF上游引物序列為5′-CTCCATCCGCTCCTTTGAT-3′，下游引物序列為5′-ACTTTCGGTGCTTGCCTTT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物序列為5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′ 。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HUVEC PDGF蛋白的表達(dá) 在含有PDGF酶標(biāo)抗體(mAb)包被的酶標(biāo)板上，加入不同濃度的PDGF標(biāo)準(zhǔn)品和收集的各組HUVEC上清液各0.1 ml，37℃孵育1 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的工作液37℃孵育1 h，鄰苯二胺底物液暗處反應(yīng)10 min，終止。酶標(biāo)儀492 nm處的測吸光度值(A)表示PDGF蛋白，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的PDGF蛋白量。

1.4 HUVEC轉(zhuǎn)染 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pcDNA3.1-CYP19-綠色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染至HUVEC(CYP19轉(zhuǎn)染組)，按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司) 說明書操作。同時以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP(空質(zhì)粒組)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HUVEC(未轉(zhuǎn)染組)作為對照。

1.5 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后 CYP19 mRNA的表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染48 h后的1.4中3組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s， 72℃ 30 s，40個循環(huán)。GAPDH基因為內(nèi)參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。CYP19上游引物序列為5′-TGGAAGGATGCACAGACTCG-3′，下游引物序列為5′-TGACCAGCCTTCTCTAGTGTTCC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCTGGGGCTCACCTGAAGGG-3′，下游引物序列為5′-GGATGACCTTGCCCACAGCC-3′ 。

1.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組及PDGF表達(dá)的檢測 將轉(zhuǎn)染后的HUVEC分為6組：①CYP19組：無血清培養(yǎng)基；②CYP19+ox-LDL組：無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL；③CYP19+ox-LDL+DHEA組：無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA；④空質(zhì)粒組：無血清培養(yǎng)基；⑤空質(zhì)粒+ox-LDL組：無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL；⑥空質(zhì)粒+ox-LDL+DHEA組：無血清培養(yǎng)基+35 mg/L ox-LDL+1.0 μmol/L DHEA。各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞在藥物作用24 h后，用實時熒光定量PCR和ELISA法分別檢測PDGF mRNA和蛋白的表達(dá)，方法同1.2和1.3。

1.7 動物模型的制備和分組 新西蘭大耳白兔25只，體重2.5～3.0 kg，成年雄性。平均分成5組：①正常對照組：常規(guī)飼料。②高脂組：高脂飼料(1%膽固醇、3%豬油)。③高脂+DHEA組：高脂飼料+0.3% DHEA。④高脂+DHEA+ATRA組：高脂飼料+0.3% DHEA+0.5 mg/(kg·d)ATRA。⑤單DHEA組：常規(guī)飼料+0.3% DHEA。各組按以上飲食喂養(yǎng)10 w后處死，從主動脈弓處取兩段動脈壁，一段-80℃冰箱凍存，另一段4%多聚甲醛固定。

1.8 實時熒光定量PCR檢測主動脈PDGF mRNA表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書分別提取各組凍存兔主動脈的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s， 72℃ 20 s，40個循環(huán)。GAPDH基因為內(nèi)參，運用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。PDGF上游引物序列為5′-TGCGGATACCTCGCCCAT-3′，下游引物序列為5′-GGTCGACCTGACTCCTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3′，下游引物序列為5′-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3′。

1.9 免疫組化法檢測主動脈PDGF蛋白表達(dá) 將用多聚甲醛固定好的主動脈石蠟包埋切片。石蠟切片脫蠟、水化后，用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法染色(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)：3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加1∶400稀釋的兔抗兔PDGF多克隆抗體，滴加1∶1稀釋的酶標(biāo)二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、封片。各組PDGF蛋白的相對表達(dá)量以細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒的平均吸光度值(A)表示，采用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，SNN-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 HUVEC PDGF mRNA和蛋白表達(dá) ox-LDL組PDGF mRNA和蛋白表達(dá)較正常對照組明顯升高(P<0.05)。ox-LDL+DHEA(低濃度)組、ox-LDL+DHEA(高濃度)組、ox-LDL+DHEA+ATRA組、DHEA組、PDGF mRNA和蛋白表達(dá)與ox-LDL組比較均明顯降低(P<0.05)。與ox-LDL+DHEA(高濃度)組比較，ox-LDL+DHEA(低濃度)組PDGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增加(P<0.05)，正常對照組、DHEA組PDGF mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組HUVEC PDGF mRNA及蛋白表達(dá)

與ox-LDL組比較:1)P<0.05；與ox-LDL+DHEA(高濃度)組比較:2)P<0.05

2.2 CYP19轉(zhuǎn)染HUVEC后其mRNA表達(dá) CYP19轉(zhuǎn)染組CYP19 mRNA的表達(dá)(4.06±0.20)均高于空質(zhì)粒組(1.09±0.19)及未轉(zhuǎn)染組(1.00±0.15，P<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染CYP19對PDGF表達(dá)的影響 CYP19+ox-LDL+DHEA組PDGF mRNA及蛋白的表達(dá)較空質(zhì)粒+ox-LDL+DHEA組均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDGF mRNA及蛋白的表達(dá)

與CYP19+ox-LDL組比較:1)P<0.05；與CYP19+ox-LDL+DHEA組比較:2)P<0.05

2.4 主動脈PDGF mRNA和蛋白的表達(dá) 高脂組PDGF mRNA和蛋白的表達(dá)較正常對照組明顯升高(P<0.05)，表現(xiàn)為明顯增厚的內(nèi)膜中見大量棕黃色顆粒。高脂+DHEA組PDGF mRNA和蛋白的表達(dá)較高脂組明顯降低(P<0.05)，內(nèi)膜厚度較高脂組薄，內(nèi)膜中棕黃色顆粒的數(shù)量較高脂組少、顏色較高脂組淡。單DHEA組與正常對照組、高脂+DHEA+ATRA組與高脂+DHEA組PDGF mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著性差異(均P>0.05)。見表3，圖1。

表3 各組主動脈PDGF mRNA及蛋白的表達(dá)

與高脂組比較:1)P<0.05；與高脂+DHEA組比較:2)P<0.05

圖1 各組主動脈PDGF蛋白表達(dá)情況 (SP，×100)

3 討 論

DHEA是性激素合成的前體物質(zhì)〔6〕， DHEA 及脫氫表雄酮硫酸鹽(DHEAS)血清水平隨著成人年齡的增長而不斷降低，研究認(rèn)為它們的缺乏可能與AS等許多老年性慢性疾病的病理生理學(xué)發(fā)生機(jī)制相關(guān)〔7,8〕。研究者在老年男性和更年期婦女中發(fā)現(xiàn)〔9〕，調(diào)整年齡后，高水平的DHEA與頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度呈負(fù)相關(guān)，提示老年人生理范圍內(nèi)的DHEA與頸AS的危險性有關(guān)。劉佳〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，DHEA 可抑制由PDGF-BB誘導(dǎo)的絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)活性，進(jìn)而抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖。本研究模型組兔主動脈內(nèi)膜有明顯脂紋形成，表明模型構(gòu)建成功。以往研究結(jié)果顯示DHEA對血脂水平的影響不大，DHEA的抗AS作用不依賴于血脂水平的改變〔11〕。本研究結(jié)果提示DHEA能夠抑制兔主動脈及HUVEC PDGF的表達(dá)。DHEA單獨存在時對PDGF的表達(dá)無明顯影響。由此推斷，DHEA能夠特異性的抑制高脂誘導(dǎo)的PDGF表達(dá)是其抗AS的機(jī)制之一。

DHEA在體內(nèi)主要是在細(xì)胞內(nèi)CYP19的作用下降解成雌酮而發(fā)揮作用〔12,13〕。由此推想，過表達(dá)CYP19，增加細(xì)胞內(nèi)CYP19的活性，應(yīng)該可以特異性地加強(qiáng)DHEA在血管局部發(fā)揮的抗AS作用。本實驗說明過表達(dá)CYP19能夠增強(qiáng)DHEA抑制高脂誘導(dǎo)的PDGF表達(dá)的作用。同時本課題組另有實驗也已證明過表達(dá)CYP19同樣能夠增強(qiáng)DHEA抑制高脂誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α表達(dá)的作用〔14～16〕。研究指出，CYP19具有多個啟動子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中由啟動子1.6發(fā)揮作用，推測補充ATRA可以激活維甲酸受體，后者被激活后可通過1.6啟動子增強(qiáng)CYP19表達(dá)〔17〕，從而增強(qiáng)DHEA的抗AS作用。本研究推測可能由于ATRA通過1.6啟動子對CYP19表達(dá)的增強(qiáng)是有限的，ATRA能否增強(qiáng)DHEA的抗AS作用及其可能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。