楚云超 黃科昌 王中偉 葛維鵬 杜梅青 林艷

(1東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院疼痛科，山東 東營(yíng) 257034；2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科)

多塞平局部應(yīng)用時(shí)可產(chǎn)生較強(qiáng)的脊髓神經(jīng)麻醉、外周神經(jīng)阻滯作用，并且在神經(jīng)病理性疼痛治療中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。但以往的研究表明，鞘內(nèi)應(yīng)用多塞平在一定濃度范圍內(nèi)有依賴(lài)性的神經(jīng)細(xì)胞毒性〔4,5〕，并證實(shí)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在多塞平誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中具有一定作用〔6〕，線粒體途徑介導(dǎo)的而非死亡受體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是多塞平的脊髓神經(jīng)毒性機(jī)制之一。右美托咪定作為具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感神經(jīng)興奮性及減少應(yīng)激反應(yīng)的高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，可加強(qiáng)局部麻醉藥脊髓麻醉和外周神經(jīng)阻滯的效果〔7,8〕；另一方面，右美托咪定可抑制原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡和減少發(fā)育期大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞損傷〔9〕，但是，其對(duì)多塞平誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡是否也有保護(hù)作用，目前少見(jiàn)報(bào)道。本研究探討右美托咪定對(duì)多塞平致神經(jīng)毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器 試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；多塞平(Sigma，美國(guó))；噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑(碧云天，中國(guó)江蘇南通)；右美托咪定(中國(guó)江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；PC12細(xì)胞(大鼠的腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)上海市生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù))。

主要儀器:酶標(biāo)儀(賽默飛，中國(guó))；光學(xué)倒置顯微鏡(Nikon，日本)；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))；細(xì)胞離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；水平流超凈工作臺(tái)(無(wú)錫易純凈化設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)在含12%胎牛血清、100 U/ml青、鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將PC12細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔加入約含5×105個(gè)細(xì)胞的200 μl細(xì)胞懸液，按20個(gè)孔接種。次日PC12細(xì)胞貼壁后分為4組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組PC12細(xì)胞不做任何處理；多塞平組PC12細(xì)胞加入多塞平，濃度為120 μmol/L；右美托咪定組加入右美托咪定，濃度為1 μmol/L，多塞平+左美托咪定組同時(shí)加入濃度為120 μmol/L的多塞平和1 μmol/L的右美托咪定。然后將PC12細(xì)胞放置于5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，溫度為37℃。處理培養(yǎng)24 h后向每孔中加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使結(jié)晶溶解后于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔570 nm處的吸光度值。依據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對(duì)照組OD值×100%)。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 處理細(xì)胞并使其濃度為(5～10)×105個(gè)/ml，以每孔2 ml將PC12細(xì)胞接種于12個(gè)孔中，分為兩組，每組設(shè)置3復(fù)孔，待PC12細(xì)胞貼壁后按照1.2.2的方式分組處理。24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁狀況及細(xì)胞密度變化并拍照。吸去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞2次，分別消化和收集各組細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min。加入400 μl 1倍上樣緩沖液后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)各細(xì)胞存活率 多塞平組、右美托咪定組、多塞平+右美托咪定組細(xì)胞存活率分別為(51.2±2.93)%、(98.10±1.76)%和(66.26±2.12)%，正常對(duì)照組(100%)與右美托咪定組相比細(xì)胞存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；多塞平組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。而多塞平+右美托咪定組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞存活率也明顯降低(P<0.01)，但卻明顯高于多塞平組(P<0.01)。

2.2 倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài) 與正常對(duì)照組相比，右美托咪定組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。多塞平組PC12細(xì)胞貼壁能力減弱，體積變小變圓，突起變短變小。多塞平加右美托咪定組細(xì)胞較多塞平組貼壁能力增強(qiáng)，體積增大，突起部分恢復(fù)，見(jiàn)圖1。

圖1 PC12細(xì)胞經(jīng)多塞平或(和)右美托咪定培養(yǎng)24 h后倒置光學(xué)顯微鏡下形態(tài)(×200)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 與正常對(duì)照組〔(3.76±0.8)%〕比較，右美托咪定組細(xì)胞凋亡率〔(4.65±0.33)%〕無(wú)明顯增高(P>0.05)；多塞平組細(xì)胞凋亡率〔(49.5±1.24)%〕顯著增高(P<0.001)，多塞平右美托咪定組細(xì)胞凋亡率〔(30.34±1.05)%〕雖明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，但明顯低于多塞平加組(P<0.01)。

3 討 論

多塞平作為三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥的主要代表藥物，具有與傳統(tǒng)的局部麻醉藥物類(lèi)似的Na+離子通道阻斷作用，局部應(yīng)用時(shí)可產(chǎn)生較強(qiáng)的脊髓神經(jīng)麻醉、外周神經(jīng)阻滯，并且在治療神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。但在前期研究中發(fā)現(xiàn)，多塞平在一定濃度范圍內(nèi)有依賴(lài)性的神經(jīng)細(xì)胞毒性；使用120 μmol/L多塞平處理PC12細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低約50%〔6〕，同時(shí)顯微鏡下可觀察到PC12細(xì)胞貼壁能力減弱，細(xì)胞體積變小變圓，突起變短變小，因此在本研究中選用此濃度。

細(xì)胞凋亡是異于細(xì)胞壞死的另一種死亡形式，以細(xì)胞特征性的形態(tài)變化及細(xì)胞DNA片段化為重要特征。其主動(dòng)性死亡程序是由多種信號(hào)通路參與完成的，Caspase介導(dǎo)途徑與凋亡征象密切相關(guān)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。本課題組前期研究結(jié)果表明，120 μmol/L多塞平孵育PC12細(xì)胞后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)明顯的細(xì)胞損傷性改變，存活率降低，凋亡率升高；給予Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK孵育后，PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變減輕，存活率升高，凋亡率降低，提示Caspase-3可能介導(dǎo)了多塞平誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔6〕。亦有其他研究表明，細(xì)胞凋亡是脊髓神經(jīng)細(xì)胞損傷作用機(jī)制之一，除此之外還包括細(xì)胞炎癥反應(yīng)、能量代謝障礙、鈣離子超載和活性氧的大量產(chǎn)生等〔10,11〕。

右美托咪定是一種具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感神經(jīng)興奮性及減少應(yīng)激反應(yīng)作用的高選擇性的α2腎上腺素受體激動(dòng)藥。右美托咪定可以抑制Caspase活性，增加抗細(xì)胞凋亡蛋白生成且減少了促細(xì)胞凋亡蛋白生成，最終能夠降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率，從而增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的生存能力〔12〕。Schoeler等〔13〕研究顯示，不同劑量的右美托咪定可保護(hù)外傷性腦損傷體外海馬細(xì)胞模型，在1 μmol/L時(shí)產(chǎn)生最大作用。因此，筆者假設(shè)能否應(yīng)用右美托咪定替代Caspase-3抑制劑減少多塞平誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明右美托咪定能保護(hù)多塞平導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞毒性改變，從另一個(gè)角度進(jìn)一步證實(shí)了多塞平神經(jīng)毒性可以用右美托咪定來(lái)改善。