龐霖霖 歐陽強 韋寧 鐘才 劉亞媛 周少旦 呂庚珉 何榮新 閆靈婉

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院 廣西醫(yī)科大學附屬民族醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530001)

帕金森病(PD)是除阿爾茨海默病外的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病呈年輕化趨勢〔1〕。目前，PD仍無明確的發(fā)病機制，研究顯示小膠質(zhì)細胞參與的神經(jīng)炎癥貫穿PD的發(fā)病及其進程中〔2〕，小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的神經(jīng)免疫細胞，根據(jù)功能狀態(tài)的不同可以分為經(jīng)典激活M1型和選擇激活M2型〔3〕，M1型主要促進炎癥因子和氧化應(yīng)激分子的釋放，造成組織損傷；M2型主要具有抑制炎癥、促進組織修復(fù)及發(fā)揮神經(jīng)保護作用。在大腦損傷、病理狀態(tài)或其他刺激下，小膠質(zhì)細胞大量激活通過釋放腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、干擾素(IFN)-γ等，這些因子又可以造成多巴胺能神經(jīng)元的死亡〔4〕。中腦黑質(zhì)是小膠質(zhì)細胞較為密集的區(qū)域，對神經(jīng)炎癥的過程比較敏感。孤核受體家族成員Nurr1基因不僅可以在體內(nèi)外發(fā)揮抑炎作用，而且對多巴胺酪氨酸羥化酶(TH)形成及多巴胺能神經(jīng)元的表型分化也發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕。

近年研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt)信號通路與PD聯(lián)系較緊密，牡荊素可以激活PI3K/AKt信號通路對PD模型的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮保護作用〔6〕；PI3K/AKt信號與PD的炎癥機制存在密切關(guān)聯(lián)，Shh信號通路激活抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與PI3K/AKt信號通路的激活有關(guān)〔7〕，目前尚無單獨研究PI3K/AKt信號通路與PD相關(guān)基因Nurr1的關(guān)系。本實驗擬分析抑制PI3K/AKt信號通路對Nurr1及抗炎因子表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 BV2細胞株(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、DMEM 高糖培養(yǎng)基、含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶、青鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)等(GIBCO公司，美國)；脂多糖(LPS，Sigma公司，美國)；LY294002(LY，Santa Cruz公司，美國)；電化學發(fā)光(ECL)液(賽默飛公司，美國)；Trizol試劑 (invitrogen 公司，美國)；熒光定量(Q)-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNase-free H2O(TakaRa公司，大連)；CCK-8試劑(碧云天，中國)β-acting、辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)；引物由invitrogen 公司合成。引物序列為β-actin正義：5′-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3′，反義：5′-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-3′；Nurr1正義：5′-AAGACCTTCTCCCAAGCACG-3′，反義：5′-GAACTGGACACTTCAACCAGC-3′；IL-4正義：5′-TCACTGACGGCACAGAGCTA-3′，反義：5′-TGTCGCATCCGTGGATATGG-3′；TGF-β1正義：5′-GGTCCTTGCCCTCTACAACC-3′，反義：5′-CCACGTAGTAGACGATGGGC-3′。

1.2 細胞培養(yǎng) BV2小膠質(zhì)瘤細胞系在高糖型DMEM 培養(yǎng)基(含10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 pg/ml鏈霉素)中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱環(huán)境為95%空氣、5%CO2、37℃。

1.3 細胞處理及分組 BV2細胞懸液以1×105/ml的密度接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天換液的同時處理細胞，細胞分為5組，對照組：正常培養(yǎng)基；LPS組：1 μg/ml LPS添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；LY+LPS組：20 μmol/L LY先處理0.5 h，再用1 μg/ml LPS添加到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；LY組：20 μmol/L LY處理。收集各組細胞上清液。

PC12細胞以1×105/ml的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后換液并處理細胞，各處理組加入BV2細胞處理后上清液，對照組加入不含細胞的培養(yǎng)液，每組分別設(shè)3個復(fù)孔，24 h后CCK-8檢測其存活率。

1.4 Western印跡檢測p-AKt蛋白含量 按上述方法培養(yǎng)和處理細胞后提取細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法檢測蛋白濃度，調(diào)平各組細胞濃度，各組取40 μg蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，275 mA 電流2 h將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用封閉液(50 g/L BSA、0.1% Tween-20 TBS)封閉后，加p-AKt抗體(1∶1 000)、AKt抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜。次日，二抗于室溫孵育2 h，化學發(fā)光顯影。

1.5 Q-PCR檢測IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA表達量 按上述方法培養(yǎng)和處理細胞后用Trizol 法提取各組細胞總RNA。在NanoDrop-1000分光光度計上檢測RNA水平，按RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR熒光染料法，反應(yīng)體系為SYBR 10 μl、ROX 0.4 μl、 cDNA 2 μl、上下游引物各0.8 μl、ddH2O 6.0 μl；ABI 7500軟件檢測分析，擴增條件：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔。

1.6 CCK-8檢測PC12細胞的存活率 按上述PC12細胞培養(yǎng)和處理后，去掉舊的培養(yǎng)基，每孔加入新的200 μl培養(yǎng)液和20 μl CCK-8工作液，避免氣泡產(chǎn)生；將96孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，酶標儀上450 nm波長檢測每組的光密度(OD)值。存活率=(用藥組平均OD值-空白組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組P-AKT、AKT蛋白表達比較 LPS組P-AKt及AKt蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)；與LPS組相比，LY+LPS組和LY組P-AKt/AKt蛋白顯著下降(P<0.01)。各組AKt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組P-AKt、AKt蛋白表達水平比較

與對照組比較:1)P<0.01;與LPS組比較:2)P<0.01;與 LY+LPS 組比較:3)P<0.01;同下表

圖1 Western印跡測各組P-AKt、AKt蛋白表達

2.2 各組IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA比較 與對照組相比，LPS組IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA顯著升高(均P<0.01)；與LPS組相比，LY+LPS組和LY組顯著升高(P<0.01)；LY+LPS組IL-4、TGF-β mRNA略高于LY組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而Nurr1 mRNA顯著高于LY組(P<0.01)，見表2。

表2 各組IL-4、TGF-β、Nurr1 mRNA表達水平比較

2.3 各組PC12細胞存活率比較 與對照組(1.000±0.062)相比，LPS組PC12細胞存活率(0.816±0.052)顯著下降(P<0.01)；LY+LPS組(0.935±0.048)顯著高于LPS組(P<0.05)；LY組(0.975±0.096)與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

PD的病因及其發(fā)病機制尚不明確，但已明確炎癥參與PD發(fā)病及其進展〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者中腦內(nèi)IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子含量升高〔9〕。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的神經(jīng)免疫細胞，約占成人大腦細胞的12%，且有與巨噬細胞相似的功能。作為大腦內(nèi)的第一道防御線，小膠質(zhì)細胞在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者大腦中存在大量激活的小膠質(zhì)細胞〔10〕，激活后的小膠質(zhì)細胞可以加速誘導(dǎo)iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達，而這些因子都會伴隨PD患者及各種PD模型中多巴胺能神經(jīng)元的退變〔11〕。中腦又是小膠質(zhì)細胞密集的區(qū)域，且小膠質(zhì)細胞一旦激活就會長期存在，多巴胺能神經(jīng)元對小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過程比較敏感，小膠質(zhì)細胞的激活可貫穿PD發(fā)病及其進程的整個過程。

近年來發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKt信號通路與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，在氧化應(yīng)激及PD模型內(nèi)存在抑制作用〔12，13〕，而神經(jīng)保護類藥物發(fā)揮神經(jīng)保護作用也是與PI3K/AKt信號通路的激活有關(guān)，如川芎嗪類似物 CXC195在6-羥基多巴誘導(dǎo)的PD模型內(nèi)通過激活PI3K/Akt/GSK3β來保護多巴胺能神經(jīng)元的凋亡〔14〕；也有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKt信號與PD的炎癥機制聯(lián)系緊密，E3泛素連接酶c-Cb1抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與PI3K/AKt信號通路有關(guān)〔15〕，金銀花的提取物類黃酮也可以通過PI3K/AKt信號通路來抑制BV2細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)〔16〕。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)中P-AKt蛋白明顯下降，PI3K/AKt信號通路被抑制，這與其他文獻結(jié)果相似〔13〕，而LY也可以明顯抑制信號通路；炎癥反應(yīng)中抗炎因子IL-4、TGF-β的表達水平升高，與其他研究結(jié)果相同〔17〕，LY預(yù)處理抑制該通路后，可以明顯上調(diào)LPS誘導(dǎo)的IL-4、TGF-β表達，而單獨抑制該通路，抗炎因子也是表達升高。Nurr1作為多巴胺能神經(jīng)元形成的關(guān)鍵基因，其表達升高在體內(nèi)和體外都有一定的抑炎作用，本文發(fā)現(xiàn)LPS刺激后Nurr1表達升高，與前期研究結(jié)果一致〔18〕，有無LPS刺激，抑制PI3K/AKt信號通路都能夠上調(diào)Nurr1表達。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)液能夠明顯抑制PC12細胞的增殖，LY+LPS則能減弱PC12細胞的抑制增殖作用，使PC12細胞存活率增加。

綜上所述，PI3K/AKt信號通路在炎癥反應(yīng)中存在一定的抑制作用，LY進一步抑制PI3K/AKt信號通路后，可以上調(diào)PD相關(guān)基因Nurr1及抗炎因子IL-4、TGF-β的表達，且對神經(jīng)元細胞也有一定的保護作用。