劉行海 買(mǎi)文麗 劉紅 鄭倩 劉華 徐策

(川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，四川 南充 637000)

隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，糖尿病患病率持續(xù)上升，而90%以上的糖尿病患者是2型糖尿病(T2DM)〔1〕。糖尿病腎損傷是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG) 是綠茶兒茶素的主要成分。近年來(lái)，EGCG的研究多集中在抗腫瘤、抗氧化和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等方面〔2～4〕。關(guān)于EGCG對(duì)T2DM患者腎臟功能的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬研究不同劑量EGCG對(duì)T2DM大鼠腎臟功能的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與動(dòng)物 EGCG(上海雅吉公司)，鏈脲佐菌素(STZ，sigma公司)，三酰甘油(TG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、鈉泵檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司)，血清胰島素(FINS)檢測(cè)試劑盒(上海市生物制藥研究所)，血糖儀(長(zhǎng)沙三諾科技公司)。雄性Wistar大鼠40只，一級(jí)，體重(195±16)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(川)2013-076。常規(guī)飼料：57%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，8%纖維素，6 %脂肪，7%其他成分。高能飼料：60%常規(guī)飼料，20%蔗糖，15%豬油，5%膽固醇。動(dòng)物及飼料均由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物模型建立與分組 隨機(jī)分出8只作為對(duì)照組，T2DM大鼠模型與對(duì)照組的建立參照本實(shí)驗(yàn)室既往方法〔5〕，最后選取空腹血糖(FBG)>7.8 mmol/L，同時(shí)伴有胰島素敏感指數(shù)(ISI)降低的23只大鼠作為T(mén)2DM模型〔6〕，其余淘汰。從成功造模大鼠中隨機(jī)分出模型組8只，EGCG低劑量組8只〔EGCG1組，50 mg /(kg·d)〕、EGCG高劑量組7只〔EGCG2組，150 mg/(kg·d)〕，EGCG各治療組每次灌胃給予EGCG，對(duì)照組和模型組每次給予等量生理鹽水。各組大鼠在給藥期間均采用常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本的收集 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于治療12 w末空腹12 h，1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，從心臟采血制備血清標(biāo)本。處死大鼠，分離右腎，去包膜后，用濾紙吸干水分稱(chēng)重。將右腎質(zhì)量與體重之比作為腎臟肥大指數(shù)(KW/BW)。左腎-70℃凍存?zhèn)溆?，用于待測(cè)腎組織丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性，及腎皮質(zhì)的分離和鈉泵活性測(cè)定。

1.4 生化及放免檢測(cè) 血糖儀測(cè)定血糖，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定TG、SCr、BUN、SOD、MDA和腎皮質(zhì)鈉泵活性，放射免疫分析法測(cè)定FINS。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況變化 與對(duì)照組比較，模型組大鼠隨著病程延長(zhǎng)，除體重呈下降趨勢(shì)外，多食多飲多尿的癥狀、活動(dòng)減少、精神萎靡、毛發(fā)晦暗等情況逐漸加重。與模型組比較，EGCG1組和EGCG2組大鼠上述癥狀與體征有不同程度改善。模型組1只大鼠死于血糖過(guò)高，EGCG2組1只大鼠死于灌胃窒息。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)變化 與對(duì)照組比較，模型組FBG，TG，Scr，BUN水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，EGCG1組及EGCG2組上述指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組生化指標(biāo)變化及SOD活性、MDA水平和KW/BW比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，表2同

2.3 各組腎組織SOD活性、MDA水平和腎臟肥大指數(shù)的變化 與對(duì)照組比較，模型組SOD活性顯著降低，MDA水平和腎臟肥大指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，EGCG1組及EGCG2組組SOD水平顯著升高，MDA水平和KW/BW顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 各組FINS、ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性的變化 與對(duì)照組比較，模型組FINS水平顯著升高，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，EGCG1組及EGCG2組FINS水平顯著降低，ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組FINS、ISI和腎皮質(zhì)鈉泵活性比較

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的模型組大鼠與T2DM患者各項(xiàng)指標(biāo)十分類(lèi)似：具有中度高血糖、高血脂，F(xiàn)INS水平不低但I(xiàn)SI顯著下降，同時(shí)具有多食多飲多尿及精神活動(dòng)下降癥狀。T2DM主要發(fā)病機(jī)制與長(zhǎng)期高血糖、高血脂對(duì)微小血管造成損傷有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與模型組比較，經(jīng)EGCG治療12 w后的T2DM大鼠，血糖、血脂水平明顯降低，ISI顯著升高。糖尿病的癥狀也得到一定程度改善，提示EGCG對(duì)T2DM有治療作用，這與本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符〔7〕。

糖尿病腎病是糖尿病一種常見(jiàn)的并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制仍不十分明了。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠腎功能異常時(shí)，其Scr 和BUN水平會(huì)增高，提示腎功能出現(xiàn)損害〔8〕。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，促進(jìn)機(jī)體對(duì)氧自由基的清除，從而保護(hù)組織免受氧自由基的損傷；MDA含量升高時(shí)，可引起組織損傷〔9〕。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組BUN、Scr 和腎臟肥大指數(shù)升高，SOD活性降低，MDA水平升高。EGCG治療各組能有效地降低T2DM大鼠的BUN、Scr 和腎臟肥大指數(shù)，提高腎組織SOD活性和降低MDA含量，從而減輕腎組織的氧化損害。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EGCG可能通過(guò)提高抗氧化能力，保護(hù)T2DM大鼠腎組織，進(jìn)而下調(diào) BUN 及 Scr 水平。

目前臨床上診斷糖尿病腎病的重要指標(biāo)之一是糖尿病患者尿中微球蛋白水含量。然而當(dāng)尿中出現(xiàn)微球蛋白時(shí)，已提示患者進(jìn)入晚期糖尿病腎病階段。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變對(duì)腎功能影響更大。腎小管的鈉泵活性可反映腎小管的功能狀態(tài)〔10〕。研究表明，長(zhǎng)期高血糖可激活腎皮質(zhì)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C，而蛋白激酶C能使鈉泵磷酸化，進(jìn)而降低其活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，T2DM大鼠12 w時(shí)腎小管鈉泵活性已顯著降低，表明糖尿病大鼠腎臟功能此時(shí)已損害。EGCG對(duì)蛋白激酶C有顯著抑制作用〔11〕。因此與模型組比較，EGCG各治療組大鼠腎皮質(zhì)鈉泵活性顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EGCG能夠穩(wěn)定T2DM大鼠腎皮質(zhì)鈉泵活性，從而起到保護(hù)腎組織的作用。

綜上，EGCG對(duì)T2DM大鼠腎臟有保護(hù)作用。該作用可能與降低T2DM大鼠的血糖血脂、腎臟氧化應(yīng)激水平，穩(wěn)定其腎皮質(zhì)鈉鉀-ATP活性有關(guān)，并具有一定劑量依賴性。