趙興旺 潘豐滿 盧文藝 黃江榮 劉蓮 黃蔚 黃祥武

(長江大學(xué) 1醫(yī)學(xué)部，湖北 荊州 434023;2第三臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科)

非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相關(guān)肝硬化〔1〕。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，NAFLD的發(fā)病率和檢出率逐年增加，普通成人患病率達20%～33%〔2〕。本研究探討加味苓桂術(shù)甘湯(RLZD)對高脂高糖飲食建立的NAFLD大鼠肝臟組織病理及脂代謝相關(guān)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3周齡Wistar大鼠，雄性，SPF級，體重50～70 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 藥物與試劑 茯苓12 g、桂枝9 g、白術(shù)12 g、黨參12 g、法半夏12 g、生山楂30 g、豨薟草15 g、紅花9 g、川芎9 g、制首烏15 g、甘草6 g，由荊州市中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室制備成濃度為0.6 g/ml的RLZD煎液；阿托伐他汀(批號H19990258)購自北京嘉林藥業(yè)；SYBR實時定量試劑(批號AK3203)購自Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號AK2303)購自Takara公司；Trizol試劑盒(批號66206)購自Invitrogen公司。

1.3 分組與給藥 60只Wistar 大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1 w后，隨機分為正常組、模型組、阿托伐他汀組、RLZD高、中、低劑量組，每組10只。除對照組外，給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料50%，豬油25%，蔗糖15%，氯化鈉10%)〔3〕，高脂高糖飼料由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心配制，連續(xù)喂養(yǎng)12 w。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)12 w。

1.4 標本采集與肝臟病理組織學(xué)觀察 大鼠稱重后乙醚麻醉，用卷尺測定大鼠鼻尖到肛門長度為體長，計算Lee指數(shù)，Lee指數(shù)(g/cm)=〔體重1/3×1 000/體長〕。頸動脈取血處死動物，于冰上取肝臟，并在冰冷的生理鹽水中洗去表面血水后用吸水紙除去表面水滴，稱取肝重，肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100%。取肝中葉做病理組織學(xué)檢查，4%多聚甲醛中固定，脫水包埋后做石蠟切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下照相觀察。余下肝組織用錫紙包裹，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 脂聯(lián)素受體(AdipoR)-2及過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)α基因表達的檢測 取肝組織(75±5)mg，使用Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增所用引物(表1)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司設(shè)計提供。檢測各引物的特異性，采用實時熒光(RT)-PCR法檢測各基因的表達水平。

表1 各基因的引物序列及片段大小

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)及Lee指數(shù)比較 與正常組比較，模型組大鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)及Lee指數(shù)顯著增高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，RLZD高、中劑量組、阿托伐他汀組大鼠體重、肝重、肝臟指數(shù)、Lee指數(shù)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，RLZD低劑量組大鼠體重、肝重、Lee指數(shù)也顯著降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

2.2 肝臟組織病理學(xué)檢測結(jié)果 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊；模型組肝臟脂肪變明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)喪失，可見大量脂肪滴沉積，脂滴將細胞核擠向一側(cè)；阿托伐他汀組脂滴較模型組少，可見部分肝小葉和肝細胞索；RLZD低劑量組脂滴比模型組稍少，有更多的小泡性脂肪變性；RLZD中劑量組脂滴較RLZD小劑量組少，但比對照組多，也有許多小泡性脂肪變性，可依稀分辨部分肝細胞索；RLZD高劑量組脂滴較少，有部分明顯的肝細胞脂肪變性，可辨出部分肝細胞索和肝小葉。見圖1。

2.3 各組大鼠肝臟AdipoR-2、PPARα表達比較 與正常組比較，模型組AdipoR-2、PPARα的表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，RLZD高、中、低劑量組AdipoR-2表達水平均較高(P<0.05，P<0.01)呈劑量依賴性升高。RLZD高劑量組PPARα顯著高于模型組(P<0.01)。見表2。

表2 各組體重、肝重、肝臟指數(shù)、Lee指數(shù)、AdipoR-2、PPARα表達比較

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

圖1 各組肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果(HE，×400)

3 討 論

NAFLD病變主體在肝小葉，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性和脂肪蓄積為病理特征的臨床病理綜合征〔4〕。NAFLD與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)，常伴隨肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征(MS)而發(fā)生，是MS的重要病理改變之一。本研究證實MS相關(guān)NAFLD模型復(fù)制成功。

PPARα主要表達在肝臟組織中，與脂質(zhì)代謝和抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，在各自的表達組織中PPARα的靶基因參與了脂肪生成、代謝〔5〕、胰島素敏感等多種生物學(xué)過程。研究表明，高脂喂養(yǎng)大鼠的PPARα mRNA表達含量降低，可引起一些與脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶基因轉(zhuǎn)錄水平降低，使脂肪酸的氧化能力減弱，從而引起脂質(zhì)堆積〔6〕，肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積則會使脂肪變性，加重胰島素抵抗，促進非酒精性肝炎的發(fā)生〔7〕。脂聯(lián)素由脂肪細胞分泌，能參與脂質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)。AdipoR-2主要表達在肝臟組織中〔8〕，在脂質(zhì)代謝中，脂聯(lián)素可能通過與AdipoR-2結(jié)合，從而激活PPARα途徑〔9〕，或者活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)而發(fā)揮作用〔10〕。AMPK激活能增加脂肪酸氧化，抑制脂肪合成。通過這些途徑使脂肪酸氧化加速及葡萄糖攝取增加，起到降低細胞內(nèi)脂質(zhì)含量和外周葡萄糖水平而改善胰島素抵抗〔11〕。

RLZD是第三批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師黃祥武主任醫(yī)師治療MS、脂肪肝的經(jīng)驗方，有健脾祛濕、活血化瘀的作用。前期研究證實，本方能夠降低MS模型大鼠血清抵抗素、升高脂聯(lián)素，降低胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)〔12〕，降低血中三酰甘油、增加高密度脂蛋白水平〔3〕，發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。

本研究提示RLZD可能通過提高肝臟AdipoR-2和PPARα的表達來調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，發(fā)揮治療NAFLD的作用。