周經(jīng)霞 陳琳 陳擘璨 邢槐杰 閆麗敏 曾超勝 吳海榮 黃裕盛 陳接桂

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570031)

腦梗死是由于生活方式、飲食習(xí)慣等多方面因素造成的一種腦血流異常疾病，如腦部血流的減少或中斷，進(jìn)而促使腦組織發(fā)生缺氧、缺血甚至導(dǎo)致腦壞死等〔1,2〕。在腦梗死的病變過程中，腦缺血灶附近的缺血半暗帶部位損傷是可逆的〔3〕，因此在缺血早期給予改善或進(jìn)行及時(shí)的血液供應(yīng)可逐步改善恢復(fù)到正常的組織水平。血管新生是目前改善血供的一種有效方法，同時(shí)是缺血性疾病恢復(fù)和損傷修復(fù)的關(guān)鍵步驟〔4〕。血管新生對(duì)腦梗死后的作用過程短暫，但由于血管新生對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性作用，可為其帶來持久性的恢復(fù)〔5〕，因此可通過人為誘導(dǎo)血管新生進(jìn)而促進(jìn)缺血區(qū)域新血管的形成成為腦梗死治療的重要方法。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子〔6～8〕。研究發(fā)現(xiàn)VEGF具有高效的誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)機(jī)體血管的生成，可用于調(diào)節(jié)機(jī)體微血管的通透性等有益功能〔9〕。近年來，VEGF被用來治療常規(guī)方法難以解決的由血循環(huán)異常導(dǎo)致的各種疾病〔10〕。盡管目前醫(yī)學(xué)上對(duì)于VEGF治療腦梗死等缺血性疾病已經(jīng)有所了解，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究擬探討VEGF通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路促進(jìn)腦梗死大鼠血管新生的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取120只SPF級(jí)的SD大鼠(購自北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重200～310 g，每天7∶00～19∶00進(jìn)行光照，室內(nèi)溫度為22～28℃，相對(duì)濕度為60%。所有實(shí)驗(yàn)大鼠每天自由活動(dòng)，并給予充足的飲水及食物。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 120只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、VEGF 1組、VEGF 2組各30只。1 w正常飼喂后進(jìn)行不同的飼養(yǎng)方法，正常組每天注射生理鹽水，模型組經(jīng)頸外動(dòng)脈進(jìn)線制造右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型，VEGF 1、2組實(shí)施MCAO處理的同時(shí)于前囟偏右5 mm、向后3 mm處顱骨鉆孔，用50 μl注射器進(jìn)入約3.5 mm后給予80 ng/只(VEGF 1組)和120 ng/只(VEGF組2)的VEGF干預(yù)。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 大鼠MCAO后，于12 d采用Zea-Longa 5分法〔11〕進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，0分為無功能損失狀況；1分為大鼠在被提起尾巴倒懸時(shí)，右前肢不能正常伸直；2分為行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈；3分為向左側(cè)傾倒；4分為不能行走或無意識(shí)。根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果，對(duì)0～4分、生命體征不平衡、呼吸困難、死亡及處死后顱內(nèi)出血的大鼠均棄之不用。于實(shí)驗(yàn)過程中造模失敗的大鼠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中給予補(bǔ)充。

1.4 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法評(píng)價(jià)大鼠腦梗死體積 在建模后第12天，取5只大鼠，采用11%的水合氯醛腹腔注射，斷頭取腦，切成2 mm厚的腦片，浸泡于3%TTC溶液中，避光條件下，37℃染色30 min，而后在4℃條件下置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h。正常組織為紅色，腦梗死灶為蒼白色。采用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件進(jìn)行處理分析，測(cè)量梗死面積〔12〕。

1.5 Neuron染色方法 取2 mm厚的冰凍腦片，于室溫復(fù)溫，丙酮固定，于37℃用牛血清白蛋白孵育30 min，后滴加一抗于4℃孵育過夜，復(fù)溫后滴加二抗孵育1 h，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚后避光封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 免疫組化法檢測(cè)腦梗死大鼠腦組織PI3K-Akt和MAPK-ERK表達(dá) 每組取5只大鼠，11%的水合氯醛麻醉后置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，迅速斷頭取出腦組織。一抗采用小鼠抗大鼠PI3K-Akt單克隆抗體(1∶1 000)和小鼠抗大鼠MAPK-ERK單克隆抗體(1∶1 000)，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液，4℃孵育過夜，二抗按說明書孵育30 min，使用二氨基聯(lián)苯胺顯色。每個(gè)標(biāo)本高倍鏡下采集圖片，最后用Image pro-plus成像系統(tǒng)分析照片。并進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)(MVD)，計(jì)數(shù)方法以內(nèi)皮細(xì)胞簇為單位標(biāo)準(zhǔn)，管腔內(nèi)直徑大于8個(gè)血管內(nèi)紅細(xì)胞或肌層較厚的予以排除，取平均值〔13〕。

1.7 實(shí)時(shí)熒光-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA轉(zhuǎn)錄水平 11%的水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦，取切割好的大鼠腦組織少量，采用液氮凍干研磨成粉狀，用RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(普利萊)進(jìn)行大鼠腦組織RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后cDNA產(chǎn)物采用RT-PCR法檢測(cè)PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 各引物設(shè)計(jì)結(jié)果

1.8 Western印跡法檢測(cè)PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達(dá)水平 待實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組取4只大鼠，11%的水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦，取150 mg腦組織，提取蛋白，采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行蛋白分離，而后進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，并用PI3K-Akt和MAPK-ERK抗體孵育過夜，TBST清洗后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育，暗室曝光，用凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)采集圖片，用LABWORK軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算其比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Zea-Longa 5評(píng)價(jià)結(jié)果 給藥前各組Zea-Longa 5評(píng)分不存在顯著性差異(P>0.05)；但給藥后第12天正常組和VEGF 1、2組的Zea-Longa 5評(píng)分均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.2 TTC染色結(jié)果 由圖1可知，MCAO處理后大鼠腦組織出現(xiàn)白色區(qū)域即壞死的腦組織，當(dāng)用VEGF處理后，白色區(qū)域縮小，且VEFG濃度越高，其腦梗死的體積越小， VEGF對(duì)腦梗死大鼠具有一定的保護(hù)作用。

表2 各組不同時(shí)間Zea-Longa 5評(píng)分結(jié)果分)

與模型組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 各組腦梗死灶TCC染色結(jié)果

為了更清楚地觀察，在建模后第12天，采用Neuron染色法對(duì)神經(jīng)元缺失程度進(jìn)行熒光染色后評(píng)價(jià)。由圖2可知VEGF 1、2組Neuron染色出現(xiàn)的陽性區(qū)域大于模型組和正常組，表現(xiàn)為VEGF對(duì)腦梗死組織起到一定的保護(hù)作用。

2.3 免疫組化法檢測(cè)腦梗死大鼠腦組織PI3K-Akt和MAPK-ERK表達(dá)及MVD 造模后第12天，與模型組相比，正常組和VEGF 1、2組PI3K-Akt、MAPK-ERK表達(dá)及MVD均顯著增高(P<0.05)，且MAPK-ERK表達(dá)與VEGF濃度之間存在一定的依賴性。見表3。

圖2 各組Neuron染色結(jié)果

表3 造模后第12天各組腦梗死組織PI3K-Akt、MAPK-ERK表達(dá)及

2.4 RT-PCR法檢測(cè)PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA轉(zhuǎn)錄水平 造模后第12天后，模型組PI3K-Akt、MAPK-ERK表達(dá)水平顯著低于正常組和VEGF 1、2組(P<0.05)，且PI3K-Akt表達(dá)與VEGF濃度之間存在一定的劑量依賴性，見圖3、表4。

圖3 各組PI3K-Akt和MAPK-ERK mRNA表達(dá)

2.5 Western印跡法檢測(cè)PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達(dá) 造模后第12天，正常組和VEGF 1、2組PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0.05)，見圖4、表5。

表4 造模后第12天各組PI3K-Akt和MAPK-ERKmRNA表達(dá)

圖4 各組PI3K-Akt和MAPK-ERK蛋白表達(dá)

組別PI3K-Akt/β-actinMAPK-ERK/β-actin正常組0.72±0.121)0.76±0.031)模型組0.27±0.010.24±0.04VEGF 1組0.89±0.051)0.91±0.031)VEGF 2組0.96±0.031)1.01±0.041)F/P值12.651/0.00119.228/0.001

3 討 論

近年來，腦梗死在老年人群中屬于常見的一種多發(fā)病，腦梗死及其并發(fā)癥也成為臨床研究的重點(diǎn)〔14〕?！吧窠?jīng)血管單元”概念特別強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)修復(fù)、血管新生為切入點(diǎn)，通過外界干預(yù)來促進(jìn)腦缺血半暗區(qū)部位的血管形成，進(jìn)而有助于機(jī)體的神經(jīng)功能恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，血管新生是指由血管內(nèi)皮干細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞〔15〕。而VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性親和作用，因此可在機(jī)體血管形成的環(huán)節(jié)中起著不可替代的作用。

PI3K-Akt是機(jī)體細(xì)胞正常生理活動(dòng)的關(guān)鍵分子，可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-Akt和MAPK-ERK通路處于活躍狀態(tài)時(shí)，能夠有效促進(jìn)機(jī)體腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而這個(gè)過程與VEGF關(guān)系密切〔17〕。PI3K-Akt信號(hào)通路在腦組織中廣泛存在，其中Akt作為PI3K的下游信號(hào)因子，控制著機(jī)體蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期及血管新生的進(jìn)展〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt能夠在基因水平上促進(jìn)與VEGF的合成，VEGF序列的啟動(dòng)子近端含有豐富的GC區(qū)域，這個(gè)區(qū)域內(nèi)具有多種轉(zhuǎn)錄因子，而PI3K在受到外界信號(hào)的刺激時(shí)，可通過調(diào)節(jié)亞基磷酸化，同時(shí)Akt基因的Ser473也被磷酸化，從而促進(jìn)PI3K-Akt激活，且刺激蛋白(SPI)上的Thr453和Thr739同時(shí)被磷酸化，最終啟動(dòng)VEGF基因轉(zhuǎn)錄〔19〕。本研究通過外界補(bǔ)充VEGF促進(jìn)機(jī)體PI3K-Akt表達(dá)，從而刺激機(jī)體內(nèi)部產(chǎn)生VEGF，達(dá)到促進(jìn)血管新生的目的。

MAPK-ERK級(jí)聯(lián)通路是目前研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程的主要途徑。MAPK-ERK信號(hào)通路屬于高度保守的三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的傳遞信號(hào)，即Raf-MEK-ERK，這條通路是經(jīng)典的調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生命活動(dòng)及其他多種病理機(jī)制的研究重點(diǎn)〔20〕。VEGF能打通此通路，且隨著VEGF濃度的增加此過程的蛋白激酶活性越強(qiáng)。

綜上，VEGF可通過刺激PI3K-Akt和MAPK-ERK通路活化，促進(jìn)大鼠腦梗死組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)生，達(dá)到抑制腦梗死病變體積增大的目的，為腦梗死的治療提供了理論基礎(chǔ)。