王鑰 張慧明 劉天睿 范采蕭 熊健良 陳玨曉 張鵬霞

(佳木斯大學(xué) 1臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

衰老是導(dǎo)致人類疾病的最大危險因子，多種慢性病、退行性疾病產(chǎn)生的重要原因就是氧化損傷與氧化應(yīng)激。隨著人體衰老，機體活性氧(ROS)大量積聚，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。因此，找出體內(nèi)干預(yù)氧化應(yīng)激過程的細(xì)胞分子生物學(xué)指標(biāo)，增強細(xì)胞抗氧化能力，延緩機體衰老，對于慢性疾病的防治具有十分重要的研究價值。人類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子(APE/Ref)-1是一類分布廣泛的生物大分子蛋白質(zhì)，可控制細(xì)胞分化、凋亡和增殖，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和氧化還原狀態(tài)〔1,2〕;作為核酸內(nèi)切酶它可以切除修復(fù)ROS引起的損傷的DNA堿基，治療ROS引起的氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞核內(nèi)該基因的高表達(dá)有助于修復(fù)并減少DNA損傷。當(dāng)前，在抗腫瘤藥物開發(fā)方面對APE/Ref-1的研究已獲得了許多新的研究進展〔3〕，而該基因?qū)ρ趸瘬p傷的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞的影響還未見報道。有文獻(xiàn)表明，棉酚對APE/Ref-1基因表達(dá)有抑制作用〔4〕，黃芪多糖對APE/Ref-1基因表達(dá)有促進作用〔5〕。本研究分別用黃芪多糖和棉酚使MRC-5細(xì)胞的APE/Ref-1基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，驗證APE/Ref-1基因?qū)RC-5細(xì)胞氧化損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 MRC-5細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)為HyClone公司產(chǎn)品；CCK-8、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶購自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、四甲基乙二酸(TEMED)、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺為Amresco公司產(chǎn)品；小鼠抗人 8-羥基-2′脫氧鳥苷(8-OHd G)抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G、β-肌動蛋白(actin)和APE/Ref-1單克隆抗體為武漢博士德生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 在DMEM培養(yǎng)液(含100 μg/ml鏈霉素、100 ml滅活FBS和100 IU/ml青霉素)中培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，于50 ml/L CO2、37℃、濕度適合的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長到70%～80%時，用2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶3比例分瓶傳代培養(yǎng)，以下實驗選取處于對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞。

1.2.2 藥物濃度的選擇 取對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞分別設(shè)計三組藥物濃度，每組設(shè)4個復(fù)孔，在96孔板中接種，每孔接種5×103個細(xì)胞、200 μl培養(yǎng)液。用CCK-8法測細(xì)胞活力：丟棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入CCK-8培養(yǎng)液(CCK-8液∶培養(yǎng)液=1∶9，實驗前配好，現(xiàn)用現(xiàn)配混勻后加入孔中)100 μl，孵育1～4 h，酶標(biāo)儀測OD值。實驗均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。選擇最適藥物濃度用于以下實驗。

1.2.2.1 過氧化氫(H2O2)處理MRC-5細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷 應(yīng)用3% H2O2(8.89 mol/L)，濃度分別為400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L，在孵育24 h后，棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，換成指定H2O2濃度的培養(yǎng)液(空白對照組和對照組換新培養(yǎng)基)，孵育24 h，CCK-8檢測細(xì)胞活力。

1.2.2.2 棉酚抑制MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因的表達(dá) 空白組：無細(xì)胞的完全培養(yǎng)基；對照組：完全培養(yǎng)液和細(xì)胞；H2O2模型組：細(xì)胞用終濃度為 700 μmol/L的H2O2完全培養(yǎng)液；棉酚處理組：將20 mg棉酚溶解，制成濃度40 mg/ml的溶液，設(shè)計濃度分別為 30、25、20、15、10 μmol/L，種板孵育24 h后，H2O2模型組和棉酚處理組加700 μmol/L H2O2處理8 h后，棉酚處理組按濃度換培養(yǎng)液，空白組與對照組更換新培養(yǎng)液，H2O2模型組更換700 μmol/L的H2O2完全培養(yǎng)液，孵育24 h。CCK-8檢測。

1.2.2.3 黃芪多糖促進MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因表達(dá) 空白組、對照組、H2O2模型組處理方法同“1.2.2.2”，黃芪多糖處理組：將20 mg黃芪多糖溶解，制成濃度為20 mg/ml溶液，設(shè)計濃度梯度為100、200、400、800 mg/L。種板后孵育24 h，H2O2模型組和黃芪多糖處理組用700 μmol/L的H2O2處理8 h，黃芪多糖處理組按濃度換培養(yǎng)液，其他組同“1.2.2.2”更換新培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。CCK-8檢測。

1.2.3 CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力 對照組：含完全培養(yǎng)液和細(xì)胞；H2O2模型組：細(xì)胞和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2；棉酚處理組：細(xì)胞和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2處理8 h后換為終濃度為20 μmol/L的棉酚；黃芪多糖處理組：細(xì)胞和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換為終濃度為700 μmol/L的H2O2處理8 h后換為終濃度為200 μmol/L的黃芪多糖。CCK-8檢測。

1.2.4 Western印跡檢測APE/Ref-1蛋白表達(dá)情況 實驗設(shè)計細(xì)胞分組及內(nèi)容同“1.2.3”。細(xì)胞接種于12孔板中，每組設(shè)3復(fù)孔，每孔加約105個細(xì)胞，500 μl培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入蛋白裂解液〔含10%苯甲基磺酰氟(PMSF)、10%蛋白抑制劑〕冰上靜置10 min后，在冰上反復(fù)吹打，用槍頭刮下并吸取至做好標(biāo)記的EP管中，置低溫離心機于12 000 r/min、4℃，離心10 min，取上清液至新的EP管，勿吸取白色黏稠物，加入5倍的上樣緩沖液，混勻，煮沸10 min，電泳(80 V、30 min，110 V、1 h)，按目的蛋白和內(nèi)參大小截取膠條，轉(zhuǎn)膜。用濃度為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，使用β-actin和APE/Ref-1的單克隆抗體，4℃孵育過夜，用TBST洗滌3次取出膜，室溫下敷二抗1 h，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法進行照相。

1.2.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測8-OHd G表達(dá) 實驗設(shè)計分為對照組、H2O2模型組、棉酚處理組、黃芪多糖處理組，在每組細(xì)胞爬片之后，用丙酮處理固定15 min，加 BSA 封閉液，置于37℃ 水浴孵育1 h，加小鼠抗人8-OHd G抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；37℃復(fù)溫1 h，PBS洗滌3次；加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃避光孵育2 h；用PBS沖洗每次5 min，3次，封片鏡檢計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計軟件行方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8測定結(jié)果

2.1.1 H2O2對MRC-5細(xì)胞的損傷作用 與對照組(抑制率為0)比較，H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有濃度依賴性，且呈正比關(guān)系。H2O2濃度為400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200 μmol/L時，細(xì)胞增殖抑制率分別為(5.2±1.1)%，(10.1±2.4)%，(19.9±4.3)%，(30.7±10.7)%，(50.3±1.1)%，(71.8±4.6)%，(81.9±1.2)%，(84.9±0.7)%，(86.9±0.9)%。由此，本實驗建立MRC-5氧化損傷細(xì)胞模型時H2O2濃度為700 μmol/L。

2.1.2 黃芪多糖對MRC-5細(xì)胞增殖的影響 與H2O2模型組〔抑制率為(37.0±1.1)%〕相比，不同濃度的黃芪多糖都可降低細(xì)胞的增殖抑制率，100、200、400、800 mg/L黃芪多糖組細(xì)胞增殖抑制率分別為(17.4±1.4)%、(7.7±1.4)%、(23.9±1.7)%、(28.4±1.1)%。當(dāng)黃芪多糖濃度為200 mg/L處理 MRC-5細(xì)胞時，細(xì)胞活性最高，細(xì)胞增殖抑制率最低。由此，本實驗以200 mg/L的黃芪多糖建立MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因表達(dá)上調(diào)模型。

2.1.3 棉酚對MRC-5細(xì)胞增殖的影響 與對照組(抑制率為0)和H2O2模型組〔抑制率為(32.9±6.4)%〕相比，不同濃度下的棉酚對 MRC-5細(xì)胞生長均有抑制作用，抑制程度隨棉酚濃度升高而增強，棉酚濃度為10、15、20、25、30 μmol/L時MRC-5細(xì)胞增殖抑制率分別為：(30.4±6.5)%，(38.4±6.4)%，(48.4±3.8)%，(59.2±1.7)%，(66.1±3.8)%。本實驗以20 μmol/L的棉酚處理細(xì)胞，建立MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因表達(dá)下調(diào)模型。

2.1.4 各實驗組MRC-5細(xì)胞存活率 在H2O2處理24 h后，細(xì)胞存活率為41.68%，而相同時間下用棉酚處理后，細(xì)胞存活率為15.89%，由引說明，棉酚降低了MRC-5細(xì)胞存活率(P<0.001)。同理，相同時間下用黃芪多糖處理后，細(xì)胞存活率為68.92%，說明黃芪多糖提升了MRC-5細(xì)胞存活率(P<0.001)。見表1。

表1 各組MRC-5細(xì)胞存活率(%，n=5)

與H2O2模型組比較：1)P<0.000 1

2.2 Western印跡檢測 與對照組(0.73±0.05)相比，棉酚處理組APE/Ref-1基因表達(dá)量(0.41±0.02)最少，H2O2模型組(0.48±0.03)多于棉酚組，黃芪多糖處理組APE/Ref-1基因表達(dá)量(0.77±0.05)接近對照組。見圖1。

2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測8-OHd G表達(dá) 與對照組相比，H2O2模型組8-OHd G的表達(dá)明顯增高。與H2O2模型組相比，黃芪多糖處理組表達(dá)相對減少，棉酚處理組表達(dá)相對增多。見圖2。

圖1 Western印跡法檢測MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1蛋白表達(dá)量

圖2 不同處理條件下的MRC-5 細(xì)胞 8-OHd G表達(dá)(熒光顯微鏡，×600)

3 討 論

APE/Ref-1是一類生物大分子蛋白質(zhì)，存在于各種細(xì)胞中，有異質(zhì)性，可有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核-質(zhì)三種分布形式〔3〕。在其異常表達(dá)或者功能活性改變、分布改變時會導(dǎo)致細(xì)胞異常表現(xiàn)，使細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生腫瘤、衰老等多種疾病反應(yīng)，因此APE/Ref-1可能是抗氧化藥物的潛在靶點〔6，7〕。APE/Ref-1表達(dá)的位置變化和(或)高表達(dá)與許多惡性腫瘤如肺癌、胰腺癌等癌癥的發(fā)展和預(yù)后有著不可忽視的相關(guān)性〔8〕。有文獻(xiàn)指出減少細(xì)胞APE/Ref-1基因的表達(dá)，可以減輕肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔9〕。Biswas等〔10〕證明腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞nox-4衍生的H2O2使DNA氧化，誘導(dǎo)APE/Ref-1的表達(dá)；抑制APE/Ref-1表達(dá)使腫瘤體積減少50%，說明內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤的增殖依賴于APE/Ref-1的表達(dá)。異常細(xì)胞質(zhì)APE/Ref-1與高級卵巢漿液腺癌的進展和化學(xué)抗性有關(guān)，預(yù)后不良〔11〕。APE/Ref-1介導(dǎo)的SIPR1過表達(dá)可能與AngⅡ 引起的血管功能障礙有關(guān)〔12〕。Chantre-Justino 等〔13〕發(fā)現(xiàn)在膀胱癌晚期患者中，APE/Ref-1等 DNA 修復(fù)酶水平高于早期患者，能修復(fù)其過剩的氧化應(yīng)激損傷，促進腫瘤發(fā)展。APE/Ref-1基因高表達(dá)，能夠增強細(xì)胞對H2O2、博萊霉素等的抵御能力〔14〕。局灶性腦缺血時存在DNA氧化損傷，且可檢測到APE/Ref-1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致無法修復(fù)損傷DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔15〕。以上研究都表明，APE/Ref-1高表達(dá)可提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡。APE/Ref-1的過表達(dá)或其表達(dá)部位改變在許多疾病中起著重要的作用。因此，研究機體內(nèi)APE/Ref-1的表達(dá)或探討其活性的改變可減緩機體內(nèi)的氧化損傷，也有利于對此類疾病的預(yù)防和治療，在特定部位抑制APE/Ref-1的表達(dá)可減緩腫瘤的發(fā)生。

機體內(nèi)自由基的形成會引起氧化損傷從而導(dǎo)致腦動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、腦缺血等疾病，這類疾病產(chǎn)生的根本原因是氧化應(yīng)激與過氧化物的堆積。事實上，身體本身存在去除和修復(fù)氧化損傷的能力。如抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)等可清除體內(nèi)的自由基；DNA受到損傷時，APE/Ref-1可以作為抗氧化酶起關(guān)鍵作用，切除或修復(fù)損傷的DNA片段。有報道表明，大腦暫時性缺血6 h，腦內(nèi)對缺血有抵抗能力的齒狀回顆粒細(xì)胞中該基因表達(dá)增加〔16〕；APE/Ref-1高水平表達(dá)有助于細(xì)胞抗缺氧損傷，而低表達(dá)APE/Ref-1細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下增加了死亡率〔17〕。可見，APE/Ref-1對細(xì)胞維持生存及發(fā)揮功能有著重要作用。另據(jù)報道，APE/Ref-1可能具有減弱H2O2引起大鼠PMVECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用〔18〕。APE/Ref-1基因敲除的小鼠在胚胎E3.5 d即死亡〔5〕。以上研究均提示，細(xì)胞中的APE/Ref-1表達(dá)下降時，細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷甚至死亡。但目前以APE/Ref-1為目標(biāo)靶點研究氧化損傷性疾病的防治卻很少。以APE/Ref-1為靶點定向提高其蛋白表達(dá)，或者當(dāng)機體產(chǎn)生氧化損傷時減少、抑制其表達(dá)下調(diào)可防治氧化損傷性疾病，這對此類疾病的研究將具有重要的科學(xué)意義。

大量實驗表明，氧化損傷可以導(dǎo)致細(xì)胞衰老〔19〕。細(xì)胞受到氧化損傷時出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯〔20〕導(dǎo)致細(xì)胞衰老及死亡。H2O2是產(chǎn)生ROS的主要形式，H2O2對細(xì)胞作用迅速，誘導(dǎo)缺氧效果顯著，該效果在一定范圍內(nèi)與濃度呈正比。它易于穿過細(xì)胞膜，在短期內(nèi)引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生各種ROS，迅速引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)過氧化、細(xì)胞功能紊亂、膜通透性增加甚至死亡〔21〕。因此，本實驗選用H2O2處理細(xì)胞，建立衰老損傷模型，模擬細(xì)胞氧化損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，棉酚可抑制MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因的表達(dá)；黃芪多糖可促進MRC-5細(xì)胞APE/Ref-1基因的表達(dá)；低表達(dá)APE/Ref-1基因的MRC-5細(xì)胞存活率低，高表達(dá)APE/Ref-1基因的MRC-5細(xì)胞存活率高；APE/Ref-1表達(dá)增加可降低MRC-5細(xì)胞 8-OHd G的含量。氧化損傷的MRC-5細(xì)胞，APE/Ref-1基因高表達(dá)可以減弱MRC-5細(xì)胞的氧化損傷并抑制其凋亡。因此，靶向APE/Ref-1可以作為預(yù)防和治療氧化損傷的研究新方向，為氧化損傷性疾病、退行性疾病、腫瘤發(fā)生的階段及預(yù)后和治療提供新的靶點，指出了研究的新思路。