朱大誠 徐麗婷 況東 潘榮斌

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

白花蛇舌草(HDW)是茜草科植物，又名蛇舌草、鶴舌草、蛇針草、蛇總管、羊須草、龍舌草等。最早記載于《新修本草》第廿卷中，取名“蛇舌”。白花蛇舌草味苦、甘，性寒，歸心、肝、脾經(jīng)，其功效為清熱解毒、利尿消腫，目前藥理研究表明白花蛇舌草具有良好的抗菌消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗化學(xué)誘變、保肝利膽等作用〔1〕。白花蛇舌草抗腫瘤作用的研究非常廣泛，且多為實體瘤，但對白血病作用的研究較少〔2,3〕。前期研究〔4,5〕證明HDW能夠誘導(dǎo)白血病CEM細(xì)胞凋亡，本實驗基于細(xì)胞凋亡信號通路理論，探討HDW是否能夠通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號通路-死亡受體途徑中相關(guān)信號分子的表達(dá)而實現(xiàn)誘導(dǎo)CEM細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 白血病CEM細(xì)胞株于2006年購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液病研究所，并長期保存于本研究室液氮中。

1.2 藥物與試劑 HDW為江西藥都樟樹中藥飲片有限公司產(chǎn)品(批號:2016091212)。RPMI1640培養(yǎng)基為賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司生產(chǎn)；胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司生產(chǎn)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、caspase8、caspase9分光光度法檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；抗caspase3(ab32351)、抗caspase8(ab32125)購自Abcam；β-actin(3457P)購自美國CST公司；山羊抗兔(CW0103)購自高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(上海立申科學(xué)儀器有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(型號3111，美國ThermoForma公司)、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)、去離子純水機(SMART-Q15UT，上海和泰儀器有限公司)、多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，Thermo Fisher,芬蘭)、通用電泳儀(美國Bio-Rad公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Protein Simple公司)。

1.4 方法

1.4.1 HDW水提取物的制備 HDW水提取物的制備按照參考文獻(xiàn)〔4〕報道的方法進(jìn)行提取得到HDW粉末,臨用前采用滅菌三蒸水配成濃度為16.6 mg/ml的HDW水提取液。

1.4.2 凋亡酶活性測定 取對數(shù)生長期CEM細(xì)胞，用含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞密度為3×105個/ml，按每瓶14.25 ml細(xì)胞懸液分瓶，共12瓶；培養(yǎng)24 h后，分成12、24、36 h 3組，每組4瓶，設(shè)定HDW水提物3個濃度組〔每瓶分別加入750 μl HDW水提物，使終濃度分別為6.64 μg/ml(HDW 1組)、33.20 μg/ml(HDW 2組)、166.00 μg/ml(HDW 3組)〕和一個對照組(加入750 μl滅菌三蒸水)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12、24、36 h提取作用相應(yīng)時間的蛋白，用BCA蛋白試劑盒測定并計算蛋白濃度。根據(jù)分光光度法檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測凋亡酶caspase3、caspase8、caspase9的活性。

1.4.3 凋亡酶蛋白的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)、實驗細(xì)胞密度、分瓶(分組)及細(xì)胞數(shù)量、藥物濃度等同實驗方法1.4.2。加藥繼續(xù)培養(yǎng)，分別于6、12、24 h提取相應(yīng)時間蛋白，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白含量并計算蛋白濃度，得出相應(yīng)上樣量，進(jìn)行免疫印跡實驗。應(yīng)用Alpha View SA軟件對免疫印跡實驗得到的條帶進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值即為目的蛋白的半定量表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 凋亡酶的活性 HDW 1、2、3組caspase3、caspase8活性表達(dá)量A值明顯高于對照組(P<0.05)，在同一時間，隨HDW水提物濃度增加，caspase3、caspase8的活性表達(dá)量也隨之增強(P<0.05)；對于同一HDW濃度，caspase3、caspase8的活性在24 h時最大，其后酶活性開始逐漸下降(P<0.05)。caspase9活性表達(dá)A值隨時間、藥物濃度的變化沒有明顯改變，與對照組比也沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1～3。

表1 HDW水提物對caspase3活性的影響(A值，

與對照組比較：1)P<0.05；與HDW 1組比較：2)P<0.05；與HDW 2組比較：3)P<0.05；與12 h比較：3)P<0.05；與24 h比較：4)P<0.05；表2、3同

表2 HDW水提物對caspase8活性的影響(A值，

表3 HDW水提物對caspase9活性的影響(A值，

2.2 caspase3、caspase8蛋白的表達(dá) 隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，凋亡酶蛋白caspase3、caspase8的表達(dá)與內(nèi)參β-actin的比值與對照組比較逐漸增大，表明caspase3、caspase8蛋白的表達(dá)呈上升趨勢，且與對照組比較差異有顯著意義(P<0.05)。見圖1，表4。

1～4：對照組、HDW 1組、HDW 2組、HDW 3組

表4 HDW水提取物對caspase3、caspase8蛋白表達(dá)的影響

與6 h比較：1)P<0.05；與12 h比較：2)P<0.05；與對照組比較：3)P<0.05；與HDW 1組比較：4)P<0.05；與HDW 2組比較：5)P<0.05

3 討 論

腫瘤細(xì)胞凋亡受阻是導(dǎo)致腫瘤的快速生長和治療困難的主要原因。細(xì)胞凋亡信號通路主要包括3條途徑，即線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及死亡受體途徑，這3條途徑之間相互聯(lián)系，并交匯于下游的凋亡酶蛋白caspase3。線粒體途徑可由外界的刺激釋放細(xì)胞色素C后引起一系列的反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑主要包括應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)、增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)和caspase信號通路。死亡受體途徑是指通過特定的死亡配體與細(xì)胞膜上相應(yīng)的死亡受體結(jié)合、相互作用而介導(dǎo)，從而激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶caspase：起始酶caspase8激活caspase3；或者切割B淋巴細(xì)胞瘤家族成員中的B淋巴細(xì)胞瘤2基因抑制性含bh3結(jié)構(gòu)域蛋白引起線粒體釋放細(xì)胞色素c，增強caspase9的表達(dá)使caspase3活化，進(jìn)而引起凋亡酶caspase的級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的一條信號通路〔6,7〕。

本實驗說明24 h之前caspase3、caspase8的活性逐漸增強，而在24 h之后此兩種酶的活性可能開始下降。細(xì)胞凋亡信號通路中，其中凋亡酶caspase8是死亡受體途徑的關(guān)鍵酶；凋亡酶caspase9既是線粒體途徑的關(guān)鍵酶，又是死亡受體途徑的關(guān)鍵酶；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的關(guān)鍵酶是caspase12；而凋亡酶caspase3是3條凋亡路徑的共同交匯點〔6〕。本實驗推測HDW水提物誘導(dǎo)CEM細(xì)胞凋亡，可能不是通過線粒體途徑來實現(xiàn)的。HDW可能是通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號通路中死亡受體途徑的特定死亡配體與細(xì)胞膜表面的相應(yīng)死亡受體結(jié)合，從而激活胞內(nèi)的凋亡酶caspase8的活性，級聯(lián)反應(yīng)升高凋亡酶caspase3的活性而導(dǎo)致白血病CEM細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是否介導(dǎo)了這一作用還有待于深入研究。