黃雪云 李七一 嚴(yán)士海 朱波

(1淮安市中醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 淮安 223001；2江蘇省中醫(yī)院心內(nèi)科)

隨著我國(guó)人民生活水平提高和飲食習(xí)慣改變，由動(dòng)脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的心血管疾病已成為我國(guó)人口主要死亡原因之一。研究表明，炎性反應(yīng)在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用〔1〕。冠心平是江蘇省中醫(yī)院治療冠心病的院內(nèi)制劑，主要由黃精、當(dāng)歸、三七、瓜蔞皮、甘松組成。臨床觀察顯示，冠心平具有保護(hù)冠心病AS血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化與抗纖維化等多靶點(diǎn)的治療作用，療效顯著〔2～4〕。本研究通過(guò)觀察冠心平對(duì)AS模型ApoE-/-小鼠血清氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化型低密度脂蛋白受體(LoX)-1蛋白及mRNA、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子(ELAM)-1水平的影響，探討該藥對(duì)AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只C57BL/6J ApoE-/-小鼠，體重20～22 g，雄性，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0008。

1.2 主要試劑和儀器 冠心平(江蘇省中醫(yī)院制備，批號(hào)：110802)；阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：1105113)；苯磺酸氨氯地平(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：1105113)；全蛋白抽提試劑盒、Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝脈電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；ELAM-1，abcam公司，貨號(hào)：AB18981；ICAM-1，Santa Cruz公司，貨號(hào)：Sc-8439。752分光光度計(jì)(上海分析儀器廠)；紫外分光光度儀(UV-2450，SHIMADZU)；核酸電泳儀(DYY-6B，北京六一儀器)；凝膠成像儀(GelDocXR，BIO-RAD)。

1.3 AS模型建立及給藥 取ApoE-/-小鼠13只，予高脂飼料(78%基礎(chǔ)飼料、10%蛋黃粉、2%膽固醇、10%豬油)，同時(shí)取3只ApoE-/-小鼠作為正常組(喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料)，喂養(yǎng)12 w后，各取1只斷頸處死。解剖取出主動(dòng)脈，10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，如顯微鏡下觀察主動(dòng)脈壁內(nèi)膜有斑塊形成，則造模成功。將余下的小鼠分為模型組(蒸餾水灌胃)、阿托伐他汀(6.67 mg/kg)組、苯磺酸氨氯地平(1.67 mg/kg)組、冠心平低劑量(0.75 g/kg)組、冠心平高劑量(1.50 g/kg)組，每組6只，藥物溶解于蒸餾水中灌胃，0.1 ml/10 g體重，1次/d。喂養(yǎng)3個(gè)月后，于末次給藥1 h后眼眶采血，分離血清，-20℃保存；液氮保存主動(dòng)脈，備用。

1.4 各組ox-LDL、ELAM-1、ICAM-1、LoX-1蛋白及LoX-1 mRNA水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中ox-LDL濃度，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。采用Western印跡法測(cè)定ELAM-1、ICAM-1、LoX-1蛋白表達(dá)水平：用抽提試劑盒提取血管組織中總蛋白，蛋白樣品處理后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜，染色，封閉，分別加入一抗、二抗孵育，加發(fā)光液，顯色，掃描條帶，保存目的條帶，應(yīng)用圖像分析儀對(duì)條帶做掃描半定量。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)LoX-1 mRNA水平：用全蛋白抽提試劑盒提取血管組織中的總RNA，取5 μg用于逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，取1 μl cDNA用于PCR,以β-actin作為內(nèi)參，引物序列：β-actin正義引物:5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′,反義引物:5′-AGAAGGAAGGCTGGAAAA-3′，產(chǎn)物條帶：460 bp；LoX-1正義引物:5′-TTAAGACCAGGGGCGT-3′，反義引物:5′-TGATGAGGTGAACTGTAGC-3′，產(chǎn)物條帶：581 bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件行t或χ2分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清ox-LDL水平 模型組血清ox-LDL的含量〔(5.71±1.27)μg/ml〕較正常組明顯升高〔(1.24±0.44)μg/ml，P<0.01〕；阿托伐他汀組、氨氯地平組、冠心平高劑量組血清ox-LDL的含量〔分別為(3.19±1.19)、(4.13±0.72)、(5.56±0.93)μg/ml〕較模型組明顯降低(均P<0.01)，冠心平低劑量組ox-LDL水平〔(2.88±1.12)μg/ml〕與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 各組血管組織中LoX-1表達(dá)水平 模型組主動(dòng)脈組織中LoX-1的含量明顯高于正常組(P<0.01)。阿托伐他汀、氨氯地平和高、低劑量冠心平組LoX-1含量均較模型組顯著降低(P<0.05，P<0.01)；高劑量冠心平組作用優(yōu)于阿托伐他汀、氨氯地平組(均P<0.05)。見(jiàn)圖1。

1～6分別為：正常組、模型組、阿托伐他汀組、氨氯地平組、冠心平低劑量組、冠心平高劑量組；與正常組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下圖同圖1 各組血管組織中LoX-1表達(dá)水平

2.3 各組血管組織中LoX-1 mRNA表達(dá)水平 模型組LoX-1 mRNA含量明顯高于正常組(P<0.01)。阿托伐他汀、氨氯地平和高劑量冠心平組LoX-1 mRNA含量均較模型組明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組血管組織中LoX-1 mRNA表達(dá)水平

2.4 各組血管組織中ICAM-1表達(dá)水平 模型組ICAM-1含量明顯高于正常組(P<0.01)。高劑量冠心平組和阿托伐他汀組ICAM-1含量明顯低于模型組(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組血管組織中ICAM-1表達(dá)水平

2.5 各組血管組織中ELAM-1表達(dá)水平 模型組ELAM-1含量明顯高于正常組(P<0.01)。高劑量冠心平組、阿托伐他汀組、氨氯地平組ELAM-1含量明顯低于模型組(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組血管組織中ELAM-1表達(dá)水平

3 討 論

低密度脂蛋白(LDL)被動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化修飾形成ox-LDL，ox-LDL能上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1及巨噬細(xì)胞刺激因子的基因表達(dá)，使單核細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁，分化成為巨噬細(xì)胞，表達(dá)清道夫受體；ox-LDL被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識(shí)別并快速攝取，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)大量膽固醇脂質(zhì)顆粒蓄積，最終形成泡沫細(xì)胞〔5〕。

此外，ox-LDL還可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞攝取ox-LDL，繼而產(chǎn)生平滑肌源性泡沫細(xì)胞；同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，引起內(nèi)皮細(xì)胞黏附蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥的進(jìn)一步發(fā)展及促進(jìn)AS的形成。ox-LDL在內(nèi)皮細(xì)胞中的主要受體是LoX-1，其能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性ox-LDL的攝取，與AS的啟動(dòng)及發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)〔6〕。LoX-1 mRNA表達(dá)水平與外周血膽固醇、LDL、動(dòng)脈硬化指數(shù)、血脂比值及腹主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊面積呈正相關(guān)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿托伐他汀、氨氯地平、高劑量冠心平均可明顯降低AS小鼠ox-LDL、LoX-1、LoX-1 mRNA水平，且高劑量冠心平抑制LoX-1作用優(yōu)于阿托伐他汀、氨氯地平；低劑量冠心平雖然對(duì)AS小鼠血清ox-LDL、LoX-1 mRNA水平降低作用不明顯，但對(duì)LoX-1有明顯的抑制作用，說(shuō)明冠心平具有調(diào)脂和抗炎作用，且其劑量的大小對(duì)抑制炎癥因子的表達(dá)存在一定的差異性和特異性。

AS發(fā)生早期，血管內(nèi)皮受損后，細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化因子、ICAM-1、ELAM-1等活性物質(zhì)，促使白細(xì)胞在病變處聚集，單核細(xì)胞游走到內(nèi)皮下變成巨噬細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞，形成脂質(zhì)斑塊。內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞在受到炎性細(xì)胞因子、過(guò)氧化脂質(zhì)等各種刺激因素作用后表達(dá)活性升高，ICAM-1基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，ICAM-1在細(xì)胞表面的表達(dá)迅速上調(diào)，其中在血管內(nèi)皮表達(dá)最強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)了白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。ELAM-1可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附，炎性刺激時(shí)，活化的大血管及毛細(xì)血管均可表達(dá)ELAM-1，脂質(zhì)過(guò)氧化可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞(EC)表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1及ELAM-1，使單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞黏附及向EC下遷移顯著增加〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高劑量冠心平具有抑制黏附因子的作用。冠心平中的黃精、當(dāng)歸、三七、瓜蔞皮、甘松具有益氣養(yǎng)陰、化痰通絡(luò)、活血祛瘀、行氣止痛之功效。本方源自古方當(dāng)歸補(bǔ)血湯(《蘭室秘藏》)加減，方中黃精易黃芪既補(bǔ)中益氣，又能滋陰，為君藥；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，補(bǔ)中有行；三七活血化瘀通脈，兩味共為臣藥；瓜蔞皮寬胸化痰、開(kāi)痹散結(jié)，為佐藥；甘松理氣止痛，與三七同入心經(jīng)，可治“卒心腹痛滿(mǎn)”，同為使藥。全方藥物性味平和，攻補(bǔ)兼施，甚切冠心病氣陰兩虛、痰瘀互阻之病機(jī)。前期的臨床研究表明，冠心平能調(diào)節(jié)血脂水平、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善心肌缺血。體外實(shí)驗(yàn)〔4〕證明，冠心平含藥血清能減少細(xì)胞上清液中ox-LDL、ICAM-1、ELAM-1含量，減少血液中單核細(xì)胞與EC黏附，繼而減少內(nèi)皮下組織巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞的形成，從而抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精，三七，甘松，當(dāng)歸，瓜蔞皮均具有抗炎癥作用〔10～14〕。阿托伐他汀為他汀類(lèi)血脂調(diào)節(jié)藥，可通過(guò)抑制肝臟內(nèi)HMG-COA還原酶及膽固醇的生物合成從而降低血膽固醇、LDL、三酰甘油水平、提高高密度脂蛋白水平。此外，該藥還有延緩AS程度、抗炎、保護(hù)神經(jīng)和抗血栓等作用〔15〕。氨氯地平可降低血脂〔16〕、下調(diào)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣ox-LDL的表達(dá)，從而減少脂質(zhì)的攝入〔17〕，并能抑制AS斑塊處單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)，下調(diào)外周血單核細(xì)胞上單核細(xì)胞趨化蛋白1受體的表達(dá)和Rho活性〔18〕，因此具有抗AS作用。用上述兩藥作為對(duì)照藥物，使本研究結(jié)果更具可信性。

ox-LDL、ICAM-1、ELAM-1均是血管內(nèi)皮損傷后細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，但三者促進(jìn)AS發(fā)生、發(fā)展的途徑不同，ICAM-1通過(guò)增強(qiáng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，ELAM-1通過(guò)增加單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上黏附及向EC下遷移，ox-LDL通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附蛋白的表達(dá)。這些炎癥影響因子在炎癥過(guò)程中相互影響、相互關(guān)聯(lián)。

綜上所述，冠心平可有效降低AS模型小鼠ox-LDL、ELAM-1、ICAM-1、LoX-1、LoX-1 mRNA水平，具有抗AS作用。