趙新永 李曉婷 周飛

(1鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 451150；2復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院)

左歸丸為經(jīng)典補(bǔ)腎古方，出自明代張景岳的《景岳全書(shū)·新方八陣》。該方在臨床上不僅應(yīng)用于治療老年性骨質(zhì)疏松，而且也被廣泛用于治療腎虛型老年性記憶衰退。研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸確實(shí)具有延緩機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌退行性變化及補(bǔ)腎健腦的功效〔1〕。衰老性記憶下降主要是因?yàn)殡S著年齡的增長(zhǎng)，大腦中樞神經(jīng)細(xì)胞的功能逐漸減退所造成。而大腦中樞神經(jīng)細(xì)胞的功能減退又和線粒體的功能正常與否密切相關(guān)。大腦消耗了人體20%的氧氣，而輸送大腦的葡萄糖中99%都是用于提供能量〔2,3〕，而這些能量的產(chǎn)生絕大部分是由線粒體的有氧代謝來(lái)提供。在衰老的大腦中，幾乎都伴隨線粒體的功能障礙〔4〕。而且如果改善線粒體的功能，就能改變細(xì)胞活性，進(jìn)而改善衰老大腦的功能〔5〕。前期研究中，在離體培養(yǎng)的海馬細(xì)胞上也發(fā)現(xiàn)左歸丸可能增強(qiáng)海馬神經(jīng)細(xì)胞的活性，但并未對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步探討〔6〕。而目前對(duì)左歸丸改善衰老性記憶減退，多集中在記憶有關(guān)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面〔7～9〕。但左歸丸能否作用于中樞神經(jīng)線粒體及作用如何，并沒(méi)有明確的研究報(bào)道。本研究擬觀察補(bǔ)腎方藥左歸丸對(duì)衰老大鼠線粒體能量代謝的作用及可能的機(jī)制變化，進(jìn)一步探索左歸丸延緩衰老和改善學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體重180～250 g,24月齡，合格證號(hào)SCXK(滬) 2016-0001，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(24±2)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,大鼠維持自由飲食、飲水。

1.2 藥物及試劑 方藥組成參見(jiàn)文獻(xiàn)〔6〕。 各中藥飲片購(gòu)自上海華宇中藥飲片有限公司。制備方法為常規(guī)水煎液制成浸膏，左歸丸藥液含生藥量為1.60 g/ml。單磷酸腺苷(AMP)鈉,二磷酸腺苷(ADP)鈉鹽,三磷酸腺苷(ATP) 二鈉鹽對(duì)照品(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；丙酮酸脫氫酶(PDH)及α-酮戊二酸脫氫酶(KGDH) 活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的山羊抗兔單抗及HPR山羊抗小鼠單抗(美國(guó)Santa Cruz公司)；過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子(PGC)-1α一抗抗體(美國(guó)Bio Vision公司)；β-肌動(dòng)蛋白(actin) 抗體；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和顯影液(美國(guó)Millipore公司) 。

1.3 儀器 Morris水迷宮及分析軟件分別為中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)研究所的DMS-2型和上海吉量軟件科技有限公司的DigBehv-MG 型分析軟件。低溫超速離心機(jī)(日本Hitachi公司CP100WX型),高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司2695型),紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Amersham Biosciences公司),PowerPacTMHC 型蛋白電泳儀，Mini Protean 3 Cell 型電泳槽、轉(zhuǎn)移槽，biorad ChemiDoc MP 型凝膠成像分析系統(tǒng)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tex公司) 。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 隨機(jī)分為對(duì)照組和左歸丸組，每組20只。灌胃給藥,按照人臨床日用藥量15 g浸膏折算大鼠給藥量,左歸丸給藥劑量為12.12 g/kg,對(duì)照組灌服等體積生理鹽水,1次/d,連續(xù)灌胃60 d。

1.5 Morris水迷宮法測(cè)試空間學(xué)習(xí)記憶能力 給藥60 d后,進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),期間繼續(xù)給藥。每天從兩個(gè)方向開(kāi)始訓(xùn)練大鼠，2次/d，連續(xù)5 d。設(shè)定水中的游動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)為70 s，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄大鼠的潛伏期。如未在最長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)找到目標(biāo)，則潛伏期為最長(zhǎng)時(shí)間，將其引至平臺(tái)上停留20 s。記錄每組的潛伏期，計(jì)算其平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 腦組織AMP、ADP、ATP含量及能荷(EC) 測(cè)定 Morris水迷宮試驗(yàn)后,取腦置于玻璃勻漿器中,加入生理鹽水在冰浴下制成20%腦勻漿液,加4%高氯酸0.5 ml混勻,4℃條件下12 000 r/min離心20 min,取0.5 ml上清液加20%氫氧化鉀(KOH)80 μl,用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定AMP、ADP、ATP的含量。EC=(ATP+0.5ADP) /(ATP+ADP+AMP)。

1.7 PDH和KGDH活性檢測(cè) 按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在600 nm下測(cè)定吸光度A變化來(lái)計(jì)算PDH和KGDH活性。

1.8 腦組織線粒體膜電位測(cè)定 具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光法測(cè)定。首先分離腦組織線粒體,用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解,再加入7.5倍的PBS混勻，然后取1.5 ml離心，棄去上清,再加入染色液1.25 ml染色3 min,染色時(shí)要注意避光和保溫，37℃下進(jìn)行。590 nm和530 nm處測(cè)定，計(jì)算A590/A530比值。

1.9 Western印跡測(cè)定PGC-1α蛋白水平 大鼠測(cè)試結(jié)束后水合氯醛麻醉。取一定量腦組織，加入4℃放射免疫沉淀(RIPA)裂解液900 μl(含有100 nmol/L蛋白酶抑制劑),0℃勻漿，13 000 r/min離心15 min,取上清液。雙縮脲法定量蛋白。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,每孔上樣量為50 μg蛋白。電壓100 V、15 min,120 V恒壓、90 min。轉(zhuǎn)膜:濕轉(zhuǎn),200 mA恒流。洗PVDF膜3次，5 min/次,封閉液封閉1.5 h。分別加一抗PGC-1α和內(nèi)參β-actin,稀釋比例參照抗體說(shuō)明書(shū)，4℃避光孵育過(guò)夜。洗膜,加入抗兔HRP(稀釋比例為1∶5 000),室溫避光，與二抗稀釋液孵育1.5 h。加發(fā)光劑曝光,壓片顯影。膠片進(jìn)行灰度掃描計(jì)算PGC-12/α-actin比值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組潛伏期比較 訓(xùn)練前3 d，兩組潛伏期逐漸縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組第4、5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。且左歸丸組穿越平臺(tái)次數(shù)〔(19.00±2.20)次〕顯著多于對(duì)照組〔(6.67±1.63)次，P<0.01〕。見(jiàn)表1。

2.2 兩組腦組織AMP、ADP、ATP含量及EC值比較 與對(duì)照組比較,左歸丸組腦內(nèi)AMP含量降低，ADP含量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而ATP含量和EC值明顯升高(P<0.05,P<0.01) 。見(jiàn)表2。

表1 兩組潛伏期比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 兩組AMP、ADP、ATP含量及EC值比較

2.3 兩組腦組織PDH和KGDH活性比較 左歸丸組腦組織PDH和KGDH活性〔(62.15±4.56)、(20.13±1.78)nmol/(min·mg)〕顯著高于對(duì)照組〔(40.23±3.56)、(16.67±1.46)nmol/(min·mg)，P<0.01〕。

2.4 兩組腦組織線粒體膜電位比較 與對(duì)照組(2.92±0.42)比較,左歸丸組(6.26±0.38)可明顯提高線粒體膜電位(P<0.01) 。

2.5 兩組腦組織PGC-1α通路蛋白表達(dá)比較 相較于對(duì)照組(0.422±0.122),左歸丸組PGC-1α表達(dá)(0.853±0.131)顯著增加(P<0.01),見(jiàn)圖1。

圖1 左歸丸對(duì)自然衰老大鼠腦組織PGC-1α蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，給予左歸丸治療衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高，和以往研究結(jié)果一致，說(shuō)明左歸丸確實(shí)能夠改善和延緩自然衰老所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)功能減退〔8,9〕。研究表明，隨著衰老，大腦中樞的能量代謝水平顯著下降，且認(rèn)知也隨著下降，而能量下降的原因是線粒體的損害和功能障礙,其主要表現(xiàn)是ATP生成下降，膜電位改變及EC顯著降低〔10〕。而本研究結(jié)果顯示,左歸丸能夠明顯增加自然衰老大鼠腦內(nèi)ATP的產(chǎn)生及EC水平,有效改善自然衰老大鼠中樞神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝。

ATP的產(chǎn)生主要和線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)代謝通路和線粒體膜的完整密切有關(guān)。在衰老人群和衰老動(dòng)物中,該循環(huán)和線粒體膜都出現(xiàn)不同的損害。在三羧酸循環(huán)中，幾乎所有的代謝關(guān)鍵酶都出現(xiàn)了不同程度的下降，其中PDH和KGDH活力的下降特別顯著〔11〕。線粒體膜電位決定了電子鏈正常傳遞及氧化磷酸的正常進(jìn)行。而左歸丸能夠改善線粒體膜的正常電位，從而提高ATP的產(chǎn)生，保證了神經(jīng)細(xì)胞的正常能量需要。

Carelli等〔12〕發(fā)現(xiàn)，在衰老細(xì)胞內(nèi)，線粒體的老化和功能障礙主要是因?yàn)榫€粒體動(dòng)力代謝下降所致，特別是增生分裂下降，不能提供新生線粒體。而PGC-1α是促進(jìn)線粒體增生和更新的重要調(diào)控蛋白，可以激活下游一系列其他蛋白轉(zhuǎn)錄因子如核呼吸因子(NRF)1和NRF2、線粒體轉(zhuǎn)錄因子(TFAM)〔13,14〕，這些蛋白會(huì)促使新的線粒體增生，替代老化的或受損的線粒體，保持線粒體的功能正常。在衰老的機(jī)體內(nèi)，通常發(fā)現(xiàn)PGC-1α蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致線粒體更新速率減慢，從而影響能量代謝〔15〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，左歸丸可以顯著促進(jìn)PGC-1α蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體的增生和更新。本研究結(jié)果提示，左歸丸可能通過(guò)促進(jìn)線粒體的及時(shí)更新而改善線粒體功能。所以，左歸丸對(duì)大腦中樞神經(jīng)的線粒體功能的改善和提高也可能是提高衰老性記憶的機(jī)制之一，而且因?yàn)楦纳屏酥袠猩窠?jīng)細(xì)胞的能量代謝，從而延緩其衰老，更符合中醫(yī)補(bǔ)精生髓的內(nèi)涵。