宋娜 蘇東峰 高宇 劉曉燕 韓桂艷 李麗慧 劉暢

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 承德 067000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因〔1，2〕，在終末期腎病患者死亡原因中占第二位。血清胱抑素(Cys)C是評(píng)價(jià)腎功早期損傷的敏感指標(biāo)，與血肌酐、尿素氮等指標(biāo)比較更加穩(wěn)定，不受炎癥、肌肉含量等的影響，是反映糖尿病患者腎功能損傷的理想指標(biāo)〔3〕。微小RNA(miR)是一類非編碼小分子單鏈RNA，通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)水平而廣泛參與生物體內(nèi)各種生理和病理過(guò)程，隨著對(duì)miR研究的深入，有證據(jù)表明miR參與了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔4〕，因而可將其作為糖尿病及其并發(fā)癥診斷與治療的靶點(diǎn)。本研究擬分析糖尿病患者miR-21與CysC和氧化應(yīng)激指標(biāo)間的關(guān)系及其診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月至2017年1月在承德醫(yī)學(xué)院附屬院診斷為2型糖尿病并接受住院治療的患者105例，男61例，女44例，年齡50～77〔平均(54.3±10.7)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①DN診斷符合世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病專家委員會(huì)推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕；②DN診斷依據(jù)Mogenson分期標(biāo)準(zhǔn)〔6〕；③本人或其家屬自愿參加本研究，接受研究中使用的檢驗(yàn)方法。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已經(jīng)確診的1型糖尿病或其他類型糖尿??；②腎臟實(shí)變，其他原因?qū)е碌哪I臟疾病，進(jìn)行血液透析治療的患者；③甲狀腺功能異常、酮癥酸中毒患者；④近期服用免疫抑制劑、腎臟毒性藥物等影響腎臟功能的藥物。

依據(jù)尿蛋白排泄率(UAER)將患者分為：A組：?jiǎn)渭兲悄虿〗M，37例；B組：早期DN組，40例；C組：臨床DN組，28例。另選30例在體檢中心檢查身體的健康者作為對(duì)照組，男女各半，平均年齡(52.9±11.5)歲，排除糖尿病、腎炎、代謝性疾病等。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有研究對(duì)象自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有多飲、多尿、不明原因體重下降等典型糖尿病癥狀，隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L，或者空腹血糖≥7.0 mmol/L，或者口服75 g葡萄糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L。DN Mogenson分期：排除引起尿蛋白的其他原因(如腎炎、發(fā)熱、泌尿系統(tǒng)感染)后，20 μg/min200 μg/min為臨床DN。

1.3 檢驗(yàn)方法 所有研究對(duì)象禁食8 h以上，并于入組后次日清晨采集空腹靜脈血10 ml，分兩管采集，一管在室溫靜置20 min后3 000 r/min離心15 min，分離得到血清分裝至EP管中，保存于-80℃冰箱備用，帶所有標(biāo)本采集齊全后，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NOX4、CysC的濃度，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。另一管采用Trizol法提取血漿總RNA，采用美國(guó)Bio-Rad公司的RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Bio-Rad公司的SYBR定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)，表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，引物和內(nèi)參基因均通過(guò)GenBank檢索得到，由Takara公司合成，mimics(內(nèi)參)正義鏈：5′-GACTTCATCACCGGGTGTAAATC-3′，反義鏈：5′-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3′；miR-21正義鏈：5′-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3′，反義鏈：5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較HSD-q檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，診斷價(jià)值分析采用受試者工作特征(ROC)分析。

2 結(jié) 果

2.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)、CysC和miR-21比較 C組miR-21表達(dá)水平最低。C組SOD濃度和miR-21表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和A、B組(均P<0.05)，C組MDA、NOX4、CysC濃度顯著高于對(duì)照組和A、B組(均P<0.05)，其余組間比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同組間氧化應(yīng)激指標(biāo)、CysC和miR-21比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與A組比較:2)P<0.05；與B組比較:3)P<0.05

2.2 相關(guān)性分析 以DN患者(B、C兩組)資料為樣本(n=68)，將其miR-21與CysC、氧化應(yīng)激指標(biāo)作相關(guān)性分析。結(jié)果DN患者miR-21與SOD呈正比(r=0.537)，與MDA、NOX4呈反比(r=-0.452，-0.518)，與CysC呈反比(r=-0.630)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 ROC分析 將A、B、C 3組miR-21資料(共105例樣本)建立ROC曲線分析模型，ROC曲線下面積(AUC)為0.802(0.95%CI=0.680～0.922)，理論閾值點(diǎn)C處miR-21水平為0.56(取整后)，對(duì)應(yīng)的敏感度Se為0.765，特異度為0.760，均在0.76以上，提示miR-21確實(shí)有較好的早期DN的診斷價(jià)值，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-21診斷DN的ROC曲線

3 討 論

DN發(fā)病隱匿，早期DN沒(méi)有明顯癥狀，而此期腎損傷可以逆轉(zhuǎn)，一旦發(fā)展為DN則不可逆轉(zhuǎn)，因此早期及時(shí)診斷對(duì)于治療和預(yù)后具有重要意義〔7，8〕。腎小球?yàn)V過(guò)率是評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo)，臨床上采用的金標(biāo)準(zhǔn)是99mTc-DTPA血漿清除率雙血漿法，但檢測(cè)方法復(fù)雜，應(yīng)用不是很理想〔9〕。目前臨床上常用UAER進(jìn)行診斷，但易受尿量、酮癥、尿路感染等因素影響，并且UAER出現(xiàn)異常時(shí)，患者已經(jīng)發(fā)展到Ⅲ期，不夠靈敏。血清CysC是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，所有有核細(xì)胞都能分泌，不受性別、年齡等因素影響〔10〕，并且腎臟是其唯一清除器官，因此其清除率主要由腎小球?yàn)V過(guò)率決定，能夠靈敏反映腎臟損傷程度〔11〕。本研究也證實(shí)早期DN患者血清CysC濃度即顯著升高，發(fā)展至DN時(shí)進(jìn)一步升高。

在DN的發(fā)展過(guò)程中，血清CysC水平升高能夠影響細(xì)胞的吞噬和趨化功能，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)是DN發(fā)生的重要病理過(guò)程，血糖控制不良，糖基化終末產(chǎn)物增加促進(jìn)氧自由基生成，引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜細(xì)胞等發(fā)生氧化損傷〔12〕。本研究對(duì)DN患者氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DN患者SOD水平降低，MDA和NOX4水平顯著增加。生理狀態(tài)下體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生少量活性氧簇，但是很快會(huì)被體內(nèi)的SOD、過(guò)氧化氫酶等清除，過(guò)量的活性氧會(huì)消耗SOD，氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA。NOX4是NADPH氧化酶的一個(gè)主要催化亞基，具有催化活性氧生成的作用〔13〕，而NOX4的表達(dá)受到miRNAs調(diào)控，F(xiàn)u等〔14〕首次發(fā)現(xiàn)miR-25通過(guò)調(diào)控NOX4的表達(dá)影響DN的發(fā)生過(guò)程，他們?cè)隗w外研究中通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-25顯著抑制了NOX4的表達(dá)，進(jìn)而抑制NADPH氧化酶的活性，降低幅度達(dá)到51%。

此外，Dey等〔15〕發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠模型的腎皮質(zhì)中miR-21表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21通過(guò)調(diào)控磷酸酶及張力蛋白同源基因PTEN的表達(dá)抑制其表達(dá)產(chǎn)物腫瘤抑制蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致纖連蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致腎細(xì)胞肥大和纖連蛋白增加。本研究表明miR-21確實(shí)參與了DN的氧化應(yīng)激過(guò)程，并且與體內(nèi)氧化應(yīng)激程度密切相關(guān)。而對(duì)miR-21與CysC的相關(guān)性分析顯示二者呈負(fù)相關(guān)，與Zhang等〔16〕在DN小鼠模型上觀察到的結(jié)果一致，提示miR-21高表達(dá)能夠減少蛋白質(zhì)排泄率，是DN的保護(hù)因素。

本研究發(fā)現(xiàn)單純糖尿病患者血清miR-21較高，早期DN患者和DN患者血清miR-21水平顯著降低，表明miR-21可能與腎小球?yàn)V過(guò)率相關(guān)，Szeto等〔17〕對(duì)DN患者尿沉渣miR-21表達(dá)量的研究也證實(shí)高水平的miR-21與患者血液透析生存期長(zhǎng)密切相關(guān)，提示miR-21對(duì)于診斷DN包括早期DN具有重要價(jià)值。此點(diǎn)亦經(jīng)ROC曲線分析予以證實(shí)。提示miR-21表達(dá)量可能是較好地診斷早期DN的敏感指標(biāo)，其與糖尿病患者腎功能損傷、氧化應(yīng)激狀態(tài)具有密切關(guān)系，或可作為DN的潛在分子診斷指標(biāo)。