賈忠寶 崔納 尹丹丹 田發(fā)明 張柳

1.北京市豐臺區(qū)南苑醫(yī)院骨外科，北京 100076 2.北京市豐臺區(qū)南苑醫(yī)院功能科，北京 100076 3.山東省濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261599 4.華北理工大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，河北 唐山 063000 5.華北理工大學附屬醫(yī)院骨外科，河北 唐山 063000

多項研究證實，骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)在不同誘導條件下具有多向分化潛能比如成骨細胞等分化[1]。多種因素及因子調(diào)控了BMSCs的分化潛能，在這其中不同特異性標志物表達水平也有不同的改變，如因子WNT3、β-catenin及Runx2、ALP、Ⅰ型膠原等。經(jīng)典而又十分保守的Wnt信號傳導通路的主要有配體(Wnt家族分子)、跨膜受體(Frizzled家族分子和LRP-5/6)、胞漿調(diào)節(jié)蛋白(Dsh、β-catenin、APC、Axin、GSK-3β等)以及核內(nèi)轉錄因子(TCF/LEF1家族)等組成。

Wnt信號通路增加骨量是通過不同的機制來實現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)控骨形成發(fā)育、生長及骨量增加過程中，經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路以時空形式發(fā)揮著重要作用[2-3]。BMSCs向成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞的不同分化結果主要是因為在細胞分化的不同階段、時期，Wnt/β-catenin信號通路在多種調(diào)劑機制下發(fā)揮了不同的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，具有多條密切相關的信號傳導通路參與到BMSCs向成骨細胞復雜的分化過程中，既往研究多側重于轉化生長因子信號傳導途徑[4]，新的研究證實在成骨細胞的分化及骨折的愈合過程中Wnt經(jīng)典信號傳導途徑至關重要[5-6]。而Wnt蛋白將信號傳入細胞內(nèi)必須要與frizzled受體結合。這條Wnt/β-catenin途徑稱為“經(jīng)典途徑”[7]。Wnt信號通路激活時, GSK-3β被募集并磷酸化LRP6，而不能磷酸化β-catenin從而避免被其降解；但在Wnt信號未激活時，GSK-3β則磷酸化β-catenin，并促使其降解。

辛伐他汀在SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞在WNT信號通路調(diào)節(jié)下向成骨細胞分化過程中早期的作用如何，相關的研究文章國內(nèi)外較少報道發(fā)表。辛伐他汀早期干預可以促進骨髓基質(zhì)干細胞成骨細胞分化過程中骨鈣素水平的增高[8]?？杀狙芯坎捎迷诘诙毎薪o藥的方法在早期分別提取RNA和蛋白來分析骨髓基質(zhì)干細胞定向誘導分化為成骨細胞培養(yǎng)過程中辛伐他丁所發(fā)揮的作用及對Wnt信號通路的影響，以進一步探討促進骨形成的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：4周齡雌性SD大鼠10只(北京大學提供SPF級，合格證號SCXK(京)2006-0 008號)。10只SD大鼠均安實驗要求單籠適應環(huán)境飼養(yǎng)1周。

1.1.2試劑和儀器：由Sigma 公司購買DMEM培養(yǎng)基、辛伐他汀、維生素C、β-甘油磷酸鈉、氫化可的松及血清。由大連寶生物公司購買Realtime PCR 試劑盒及Trizol (Invitrogen)，引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1提取及體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細胞：取4周齡SD大鼠的股骨和脛骨。收集由培養(yǎng)基沖洗出來的骨髓細胞于離心管中，以1 000 r/min的速度離心10 min，棄上清，應用完全DMEM培養(yǎng)液重懸吹打后每只大鼠的細胞接種于一個培養(yǎng)瓶中，擰松瓶口并在37 ℃恒溫箱中以含有50 mL/L(體積分數(shù))的二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)2 d后換液，后期視情況每間隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液。待細胞貼壁并增殖至培養(yǎng)瓶底的4/5后加入誘導培養(yǎng)基，待細胞增殖融匯成致密單層后再傳代接種于新的培養(yǎng)瓶。

1.2.2分組與加藥：在第二代細胞第一次換液時取生長良好的細胞更換誘導培養(yǎng)基并隨機分組，分為對照組(G1)和實驗組(G2)。G2加入誘導培養(yǎng)基(含有1×10-7mol/L SIM)，對照組加入含有等量DMSO的培養(yǎng)基。以后視細胞生長情況間隔2～3 d全量換液，每次換液均要求實驗組加入含有辛伐他丁的誘導培養(yǎng)基，G1加空白完全培養(yǎng)，分別在12 h和36 h，提取總RNA和蛋白質(zhì)。

1.2.3Real-time RT-PCR：選取第二代細胞在經(jīng)誘導分化12 h和36 h后兩組分別提取細胞總RNA，定量后經(jīng)過反轉錄合成第一鏈cDNA進行PCR反應，同批擴增待測基因與內(nèi)參基因(β-actin)，采用溶解曲線法進而來鑒定擴增產(chǎn)物的特異性和片段大小，應用梯度稀釋內(nèi)參基因法制定相對標準曲線。PCR反應體系的總體積為25 μL，其中上下游引物各0.5 μL、12.5 μL的STBR? Premix Ex TapTM，2 μL的DNA模板及dH2O 9.5 μL。PCR反應條件：在經(jīng)過95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。對RT-PCR結果進行半定量分析。查出WNT3的cDNA全長序列后應用軟件Primer 5.0設計因子的引物并由Invitrogen公司合成。詳見表1。

表1 WNT3及β-actin引物序列Table 1 List of PCR primers

1.2.4Weten blot：選取第二代骨髓基質(zhì)干細胞在經(jīng)誘導培養(yǎng)后用辛伐他汀干擾12 h和36 h，兩組細胞分別提取總蛋白，以50 μg/孔的標準上樣行凝膠電泳進行蛋白分離；分離后將蛋白轉移至PVDF膜于BSA中在室溫環(huán)境下封閉2 h，將膜與一抗WNT3(1∶200)及內(nèi)參β-actin(1∶1500) 在4 ℃環(huán)境中孵育過夜。第2天加入經(jīng)過堿性磷酸酶標記的二抗(1∶1000稀釋)，改為在37 ℃環(huán)境下孵育2 h，TBST緩沖液沖洗3次后用BCIP/NBT進行顯色。結果通過Image J圖像分析軟件進行掃描測定圖象灰度，得出目的及內(nèi)參蛋白的光密度比值，即為目的蛋白表達水平的半定量指標。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗結果通過均值±標準差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長狀態(tài)觀察

SD大鼠骨髓細胞中有大量懸浮細胞在第1次換液時會被丟棄，而在沉淀細胞中可見到單核細胞，呈現(xiàn)典型成纖維細胞樣生長以梭型或多邊型為主。細胞融匯瓶底至9/10大概需要10 d左右。

2.2 Real time RT-PCR結果

實驗組與對照組兩組細胞分別經(jīng)誘導培養(yǎng)及誘導培養(yǎng)加用辛伐他汀干預12 h后，Real Time-PCR分析，實驗組因子WNT3 mRNA比對照組的表達水平增高，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)過36 h后，兩組間因子WNT3 mRNA的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 Real Time-PCR測定WNT3 MrnaTable 2 Real Time-PCR evaluation of WNT3 mRNA

注：實驗組與對照組相比，△△P<0.01；△P<0.05。

2.3 Western blot

兩組細胞在經(jīng)誘導培養(yǎng)及加用辛伐他汀干預12 h后，因子WNT3的蛋白表達水平變化不大。36 h后WNT3蛋白表達水平實驗組高于對照組，但是兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表 3 WNT3蛋白的表達Table 3 The expression level of WNT3 protein

注：實驗組與對照組相比，△P>0.05。

3 討論

通過本實驗發(fā)現(xiàn)，體外短期應用辛伐他汀干預BMSCs 12 h及36 h后對其WNT信號通路主要相關因子在骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化早期有一定作用。

骨髓基質(zhì)干細胞的多向分化潛能在多項研究中已有所發(fā)現(xiàn)，比如在誘導劑誘導下能夠使BMSCs向成骨細胞分化。同時，BMSCs也可向軟骨細胞分化[9]。不過在BMSCs向成骨細胞定向分化過程中參與的信號通路較多，其中主要的WNT信號通路相關因子參與調(diào)控并發(fā)揮重要作用[10-11]。

不論在骨組織工程學還是在骨折愈合及骨質(zhì)疏松治療學方面都具有重要價值的成骨細胞，如何使骨髓基質(zhì)干細胞定向分化有著重要的研究價值。Wnt信號通路在MSCs體外分化所起的作用隨仍存有爭議，但大部分研究證實了其積極作用。而早期階段的作用及其機制鮮有報道。有研究表明，在BMSCs向成骨細胞分化過程中經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮積極作用[12-13]，而有的研究結果與之不一致而相沖突[14]。有的研究發(fā)現(xiàn)通過別的通路也能達到促進成骨細胞分化的作用[15]。盡管目前存有爭議，但是都能一致認可BMSCs強大的成骨潛能，研究者認為BMSCs也參與了骨修復愈合過程，成為增加骨量、修復骨損傷最有前途的干細胞之一。

有關辛伐他汀在成骨分化早期所發(fā)揮作用的報道較少，涉及WNT信號通路早期的也鮮有報道。辛伐他汀在早期干預能促進骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[16-17]。劉昊等[18]的研究也證實了這種分化潛能。通過本實驗，兩組間在辛伐他汀干預12 h及36 h后，WNT信號通路主要因子WNT3 mRNA表達水平實驗組與對照組相比明顯升高，而蛋白表達水平兩組間未見明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過辛伐他汀干預對SD大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的成骨分化有一定促進作用，涉及其中的重要信號通路主要因子的表達mRNA及蛋白并不一致，可能與觀察時限有關，也可能有其他因素參與其中，其具體調(diào)節(jié)機制及其與其他不同因子或不同通路之間相互間作用有待進一步證實。