白濤敏,王潔英,劉 娜,李 瑞

(陜西省人民醫(yī)院兒科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:wangjieying@163.com)

過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一種常見的免疫性炎癥疾病,多發(fā)于兒童時(shí)期。普遍認(rèn)為,過敏性紫癜患兒體內(nèi)免疫功能紊亂與其病理、臨床表現(xiàn)等關(guān)系密切[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,可調(diào)控細(xì)胞增殖和分化等過程,參與多種疾病的發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn),miR-155可通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗原提呈、T細(xì)胞分化等過程影響免疫反應(yīng)[2]。Th17細(xì)胞分化依賴于miR-155,miR-155敲低的T細(xì)胞不能正常分化為Th17,研究證實(shí),過敏性紫癜患兒外周血Th17/Treg失衡,參與該疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本研究初步探討miR-155能否通過調(diào)控Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜的發(fā)生、發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016-04～2017-10本院接收診治的79例過敏性紫癜患兒為研究對(duì)象,其中男42例,女35例,年齡2-13歲,平均年齡(7.59±4.16)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合過敏性紫癜患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];②首次發(fā)病;③未使用任何糖皮質(zhì)激素等藥物。另選取同時(shí)期在本院體檢的60例健康兒童作為對(duì)照,其中男34例,女26例,年齡2-14歲,平均年齡(7.81±4.37)歲。過敏性紫癜患兒和對(duì)照組在年齡、性別等方面無顯著差異,具有可比性。本研究經(jīng)本院病理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,患者家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

FACS Calibur流式細(xì)胞儀,Becton Dickimn公司。DU-800型紫外分光光度計(jì),美國(guó)貝克曼庫爾特公司。Trizol試劑,Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒均購自Fermentas公司。引物由北京奧科公司設(shè)計(jì)并合成。白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集 采集所有受試者清晨空腹靜脈血6 ml,置于抗凝管中,分為2管,每管3 ml。取其中一管,采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞,用于檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞比例。另一管離心(4 ℃,3 500 r/min,10 min),取上層血清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞比例 參考文獻(xiàn)方法[5],采用EPICS-XL流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血Th17和Treg細(xì)胞。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)血清 采用Trizol法提取血清中總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。RNA溶液在260 nm和280 nm處吸光值的比值大于1.8。嚴(yán)格參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明,將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表1。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,總共進(jìn)行45個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法,以U6作為內(nèi)參計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)水平,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算RORγt和Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá) 取1.3.1中收集的血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法分別按照IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10和TGF-β1試劑盒說明書檢測(cè)其表達(dá)水平。

表1 引物序列

Table 1 The primer sequences

引物 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′)U6CACTGGGCCATGCTAATCTTCTCGTGCAGGGTCCGAGGTmiR-155CGAGAGGTAACATTCAACGCTGTCGTGCAGGGTCCGTGGAGAPDHTGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGTGGTGAAGACGCCAGTAGRORγtGCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCGFoxp3GCCAAGGCTCAGTCATGAGACCTCACAGGTGATAACCCCG

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過敏性紫癜患兒和對(duì)照組外周血miR-155表達(dá)比較

過敏性紫癜患兒和對(duì)照組外周血miR-155表達(dá)水平分別為1.79±0.08和1.03±0.02。與對(duì)照組相比,過敏性紫癜患兒外周血miR-155表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

2.2 過敏性紫癜患兒和對(duì)照組Th17和Treg細(xì)胞比例比較

與對(duì)照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),Treg細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05,見表2)。

組別nTh17細(xì)胞Treg細(xì)胞對(duì)照組600.49±0.184.86±0.73HSP組791.26±0.432.35±0.57 t13.02222.767 P0.0000.000

2.3 過敏性紫癜患兒和對(duì)照組Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子比較

與對(duì)照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt顯著升高(P<0.05),Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3顯著降低(P<0.05,見表3)。

組別nRORγtFoxp3對(duì)照組601.06±0.021.04±0.03HSP組791.84±0.080.47±0.01 t73.734157.873 P0.0000.000

2.4 過敏性紫癜患兒和對(duì)照組Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子比較

與對(duì)照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均顯著升高(P<0.05),Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1均顯著降低(P<0.05,見表4)。

2.5 過敏性紫癜患兒miR-155表達(dá)與各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性

過敏性紫癜患兒外周血miR-155與Th17細(xì)胞比例、轉(zhuǎn)錄因子RORγt以及相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相關(guān)(P<0.05),與Treg細(xì)胞比例、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3以及細(xì)胞相關(guān)因子IL-10和TGF-β1均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,見表5)。

組別nIL-6IL-17IL-22IL-23IL-10TGF-β1對(duì)照組603.15±0.426.59±3.166.13±3.4835.21±10.2589.46±20.1787.39±11.54HSP組795.29±0.6726.19±12.4319.38±7.6847.39±12.5854.19±14.2851.08±8.13 t-21.70311.91612.4226.11412.06721.756 P-0.0000.0000.0000.0000.0000.000

表5 過敏性紫癜患兒miR-155表達(dá)與各檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性

Table 5 Correlation between the expression of microRNA-155 and the detection indexes in children with Henoch-Schonlein purpura

指標(biāo) miR-155 rPTh17細(xì)胞0.4670.023RORγt0.5730.012IL-60.4920.018IL-170.5190.015IL-220.3710.041IL-230.3860.034Treg細(xì)胞-0.4910.019Foxp3-0.5760.011IL-10-0.6150.006TGF-β1-0.5830.009

3 討論

miR-155是由23個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNA,定位于人21號(hào)染色體,高表達(dá)于人胸腺、脾臟、肺等富含免疫細(xì)胞的器官。郭瑩等[6]研究發(fā)現(xiàn),免疫性血小板減少癥患者外周血CD19+B細(xì)胞中miR-155表達(dá)水平明顯上調(diào),并且與B淋巴細(xì)胞功能和細(xì)胞內(nèi)抗體的產(chǎn)生密切相關(guān),參與免疫性血小板減少癥的發(fā)病過程。Johansson等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-155敲低的過敏性氣道炎癥小鼠表現(xiàn)出較低的炎癥水平,miR-155是過敏性氣道炎癥中2型固有淋巴細(xì)胞和IL-33信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示,過敏性紫癜患兒外周血miR-155表達(dá)水平較對(duì)照組也顯著升高,提示miR-155可能參與過敏性紫癜的發(fā)病過程。

Th17和Treg細(xì)胞均屬于CD4+細(xì)胞亞群,Th17細(xì)胞可分泌IL-17等炎癥細(xì)胞因子,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生更多的趨化因子及炎癥細(xì)胞因子,從而介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及自身免疫性疾病的發(fā)生[8]。RORγt作為Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)控Th17細(xì)胞的分化與功能。RORγt可與活化T細(xì)胞因子相互作用,抑制IL-2的生成,間接地促進(jìn)Th17細(xì)胞表達(dá)。Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β通過誘導(dǎo)Foxp3蛋白的表達(dá),進(jìn)而維持Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能。機(jī)體內(nèi)過量的IL-6不僅能夠抑制TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3表達(dá),還能夠促進(jìn)RORγt表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)CD4+細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞。Th17/Treg平衡是機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素,在多種炎性疾病和免疫性疾病中被廣泛關(guān)注。張玲等[9]研究發(fā)現(xiàn),過敏性紫癜患兒外周血Th17、Treg細(xì)胞及其關(guān)鍵調(diào)控因子IL-6、TGF-β等水平均較健康對(duì)照表達(dá)異常,Th17/Treg平衡失調(diào)可能參與該疾病的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,過敏性紫癜患兒外周血Th17細(xì)胞比例、轉(zhuǎn)錄因子RORγt、相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-22和IL-23顯著升高,而Treg細(xì)胞比例、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1顯著降低,與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致,提示過敏性紫癜患兒外周血Th17/Treg細(xì)胞呈平失調(diào)狀態(tài),通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡可能為過敏性紫癜的治療提供新方法或新思路。

Th17細(xì)胞的分化依賴于miR-155表達(dá),多種免疫相關(guān)性疾病中miR-155表達(dá)異常與Th17細(xì)胞分化異常相關(guān)。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-155敲除的小鼠T細(xì)胞尤其是Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)顯著減弱,miR-155調(diào)節(jié)慢性心臟排斥反應(yīng)中Th1/Th17相關(guān)的炎癥,可能是減弱心臟移植排斥反應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,miR-155與Th17細(xì)胞比例、RORγt、IL-6、IL-17、IL-22和IL-23均呈正相關(guān),與Treg細(xì)胞比例、Foxp3、IL-10和TGF-β1均呈負(fù)相關(guān),猜測(cè)miR-155也可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜發(fā)生過程,是該疾病的潛在治療靶標(biāo)。

綜上所述,過敏性紫癜患兒外周血miR-155過表達(dá),Th17/Treg細(xì)胞失衡,miR-155與Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子呈正相關(guān),與Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān),miR-155可能通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡參與過敏性紫癜發(fā)生過程,是治療過敏性紫癜的新靶點(diǎn)。