張玉潔,張 燕,孟新玲,劉 婷,陸 潔,許奔奔,徐 夢

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腦病一科,烏魯木齊 830000;*通訊作者,E-mail:269667188@qq.com)

阿爾茨海默病(AD)是老年人中最常見的神經(jīng)退行性疾病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2016年癡呆癥報告,全球29個國家每年有4 750萬人患有癡呆癥和770萬例新病例[2],據(jù)估計,2030年癡呆癥人數(shù)預(yù)計將達(dá)到7 560萬人,到2050年將達(dá)到3倍,達(dá)到1.355億人[3];其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,遺傳因素的研究意義逐漸受到重視。近年全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies,GWAS)及薈萃分析發(fā)現(xiàn)分揀蛋白相關(guān)受體1(SORL1)基因的多態(tài)性與AD風(fēng)險相關(guān)[4,5],研究表明神經(jīng)元在SORL1上具有風(fēng)險或保護(hù)性變異,保護(hù)性變異神經(jīng)元增加SORL1的表達(dá),這可能降低散發(fā)性阿爾茨海默病的風(fēng)險[6]。目前尚未見新疆哈薩克族AD患者SORL1基因相關(guān)研究,因此本研究采用病例對照方法探討SORL1基因rs2070045位點及rs3824968位點多態(tài)性與新疆地區(qū)哈薩克族、漢族人群SAD患者的相關(guān)性,為AD的基因遺傳學(xué)研究提供的一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

收集來自新疆各地2016-01～2018-02在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)退行性疾病臨床大數(shù)據(jù)庫的AD患者共118例,均為散發(fā)性;其中哈薩克族58例,漢族60例,男性75例,女性43例,年齡在49-91歲之間,平均(74.6±7.85)歲。選擇與病例組年齡、性別、地域環(huán)境因素、生活方式和民族習(xí)俗相匹配的,并無血緣關(guān)系的非AD患者或健康志愿者作為對照組,共139例,其中哈薩克族79例,漢族60例;男性75例,女性64例;年齡58-81歲,平均(72.7±6.21)歲。

本研究為病例對照研究,所有研究對象均簽署知情同意書,通過新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 空腹抽取受試者肘靜脈血5 ml,EDTA抗凝,置于-80 ℃凍存,分批進(jìn)行DNA的提取。

1.2.2 競爭性等位基因特異性PCR(KASP)技術(shù)及DNA測序檢測SORL1基因位點多態(tài)性 研究中的SNP基因座信息來自公共數(shù)據(jù)庫NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫,查詢基因SORL1標(biāo)準(zhǔn)序列(源自網(wǎng)絡(luò)http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene bank/genebank)。其位點序列號為rs2070045及rs3824968。采用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計SNP rs2070045及rs3824968位點的KASP引物http://Primer3.ut.ee/),見表1。用Qiagen公司的HotStar Taq PCR試劑盒進(jìn)行多重PCR,獲得PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿酶(SAP)(購于Promega)和外切酶Ⅰ(EXOⅠ)(購于Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物用蝦堿酶(SAP)(購于Promega)純化后在ABI3730xl上樣。SNP分型采用GeneMapper4.1(Applied biosystems)進(jìn)行序列比對分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗,采用基因計數(shù)法描述SAD及對照組基因頻率和基因型分布;其計數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,SAD及對照組之間比較采用χ2檢驗和Firsher精確概率法;數(shù)據(jù)使用SPSS22.0進(jìn)行處理。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)概率檢驗,檢驗水準(zhǔn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 SNP位點引物名稱和PCR引物序列

Table 1 SNP site primer names and PCR primer sequences

位點 引物名稱 PCR引物序列rs2070045Primer-Allele FAMAACGACTGCAGGGACTGGTCTPrimer-Allele HEXAACGACTGCAGGGACTGGTCGPrimer-CommonTGCTGTCAACTGAGTCCAGGAAGTArs3824968Primer-Allele FAMACCTGTAGTAGACATTATATACACAAGATPrimer-Allele HEXACCTGTAGTAGACATTATATACACAAGAAPrimer-CommonACTTTGACCTGGATGAGGCCCAAAA

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗

漢族及哈薩克族病例組與及對照組SORL1基因rs2070045、rs3824968位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。rs2070045位點哈薩克族AD組(P=0.114)、哈薩克族對照組(P=0.051)、漢族AD組(P=0.117)、漢族對照組(P=0.262)基因型分布均吻合度良好;rs3824968位點哈薩克族AD組(P=0.071)、哈薩克族對照組(P=0.070)、漢族AD組(P=0.137)、漢族對照組rs3824968(P=0.233)基因型分布均吻合度良好。

2.2 基因多態(tài)位點檢測結(jié)果和電泳圖、測序圖、KASP分型圖結(jié)果

AD患者電泳結(jié)果見圖1。AD患者SORL1基因rs2070045、rs3824968位點測序峰圖分析見圖2。PCR反應(yīng)程序結(jié)束后將樣本置于ABI Q6中檢測FAM及HEX熒光信號,收集熒光信號,儀器根據(jù)每個樣本檢測的熒光信號值自動分型,Homozygous為純合子,Heterozygous為雜合子,KASP分型見圖3。

2.3 病例組和對照組SORL1基因rs2070045、rs3824968位點基因型及等位基因頻率比較

病例組與對照組SORL1基因rs2070045(χ2=0.671,P=0.715)、rs3824968(χ2=0.431,P=0.806)多態(tài)位點的基因型分布比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

兩個基因多態(tài)性位點的等位基因頻率rs2070045(χ2=0.791,P=0.374)和rs3824968(χ2=0.471,P=0.518)與阿爾茨海默病的相關(guān)性分析均沒有發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。

A. rs2070045位點B. rs3824968位點圖1 AD患者rs2070045和rs3824968位點電泳圖Figure 1 Electrophoresis map of rs2070045 locus and rs3824968 locus in AD patients

A. rs2070045位點測序結(jié)果B. rs3824968位點測序結(jié)果圖2 AD患者rs2070045和rs3824968位點測序結(jié)果Figure 2 Sequencing results of rs2070045 locus and rs3824968 locus in AD patients

A. rs2070045 KASP分型 B. rs3824968 KASP分型圖3 rs2070045和rs3824968 KASP分型圖Figure 3 KASP typing of rs2070045 and rs3824968

表2 rs2070045及rs3824968在阿爾茨海默病組和對照組的基因型分布比較例(%)

Table 2 Comparison of genotype distribution of rs2070045 and rs3824968 between Alzheimer’s disease group and control groupcases(%)

組別rs2070045GGGTTTχ2Prs3824968AAATTTχ2PAD組57(48.3)42(35.6)19(16.1)0.6710.71549(41.5)44(37.3)25(21.2)0.4310.806對照組60(43.5)52(37.7)26(18.8)61(43.9)53(38.1)25(18.0)

*因漢族對照組一人rs2070045基因型未測出,因此少1例

表3 rs2070045及rs3824968在阿爾茨海默病組和對照組的等位基因頻率比較例(%)

Table 3 Comparison of allele frequencies of rs2070045 and rs3824968 between Alzheimer’s disease group and control groupcases(%)

組別rs2070045GTχ2Prs3824968ATχ2P AD組156(66.1)80(33.9)0.7910.374142(60.2)94(39.8)0.4710.518 對照組172(62.3)104(37.7)175(62.9)103(37.1)

*因漢族對照組一人rs2070045等位基因未測出,因此少1例

2.4 按族別分層分析兩個SNPs與阿爾茨海默病的相關(guān)性

我們進(jìn)一步對阿爾茨海默病組rs2070045、rs3824968位點的基因型分布進(jìn)行了族別分層分析。結(jié)果顯示,阿爾茨海默病組的2個位點基因型分布在兩個民族中及兩民族之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表4);rs2070045、rs3824968的等位基因在兩個民族及兩民族之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表5)。

表4 阿爾茨海默病組rs2070045及rs3824968基因型分布在族別上的差異例(%)

Table 4 Differences in genotype distribution of rs2070045 and rs3824968 in Alzheimer’s disease groupcases(%)

組別 rs2070045GGGTTTχ2Prs3824968AAATTTχ2P漢族0.0910.9560.9630.618 AD組30(50.0)21(35.0)9(15.0)21(35.0)24(40.0)15(25.0) 對照組29(49.2)22(37.3)8(13.6)25(41.7)24(40.0)11(18.3)哈薩克族0.9530.6210.1030.905 AD組27(46.6)21(36.2)10(17.2)28(48.3)20(34.5)10(17.2) 對照組31(39.2)30(38.0)18(22.8)36(45.6)29(36.7)14(17.7)

*哈薩克族與漢族AD間rs2070045位點基因型頻率分布比較,χ2=0.177,P=0.915>0.05;不同民族AD患者rs3824968位點基因型頻率分布比較,χ2=2.330,P=0.312>0.05;因漢族對照組一人rs2070045基因型未測出,因此少1例

表5 阿爾茨海默病組rs2070045及rs3824968等位基因頻率在族別上的差異例(%)

Table 5 Differences in the frequency of rs2070045 and rs3824968 allele frequencies in the Alzheimer’s disease groupcases(%)

組別 rs2070045GTχ2Prs3824968ATχ2P漢族0.0020.9611.0970.295 AD組81(67.5)39(32.5)66(55.0)54(45.0) 對照組80(67.8)38(32.2)74(61.7)46(38.3)哈薩克族1.1610.2810.0740.785 AD組75(64.7)41(35.3)76(65.5)40(34.5) 對照組92(58.2)66(41.8)101(63.9)57(36.1)

*哈薩克族與漢族AD組rs2070045位點等位基因頻率比較,χ2=0.213,P=0.644>0.05;不同民族AD患者rs3824968位點等位基因頻率分布比較,χ2=2.722,P=0.099>0.05;因漢族對照組一人rs2070045等位基因未測出,因此少1例

3 討論

SORL1基因位于11號染色體上,編碼蛋白質(zhì),其具有許多不同功能的功能域,包括物質(zhì)運輸、分子伴侶活性、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)分選。SORL1充當(dāng)?shù)矸蹣忧绑w蛋白(amyloid precursor protein,APP)的分選受體,其將來自內(nèi)體的分子再循環(huán)回到反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)以減少Aβ產(chǎn)生,這是AD的病理生理學(xué)途徑中的重要組分[7,8]。Raghavan等[9]發(fā)現(xiàn),在沒有SORL1基因的情況下,APP被釋放到晚期內(nèi)體中,在內(nèi)體中它被β-蛋白酶和γ-蛋白酶切割產(chǎn)生淀粉樣蛋白β。SORL1突變導(dǎo)致阿爾茨海默氏病的神經(jīng)變性的機(jī)制與破壞其綁定APP的能力有關(guān)。細(xì)胞生物學(xué)實驗表明[10],SORL1過度表達(dá)導(dǎo)致Aβ過量產(chǎn)生,而SORL1過表達(dá)顯著降低細(xì)胞APP和細(xì)胞外Aβ。

我們首次分析了新疆哈薩克族人群SORL1基因rs2070045位點及rs3824968位點與AD的相關(guān)性。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)新疆漢族及哈薩克族SORL1基因rs2070045位點及rs3824968位點與AD有關(guān)聯(lián)性;經(jīng)族別分層后亦未發(fā)現(xiàn)這兩位點在新疆漢族與哈薩克族有顯著差異。Liu等[11]研究表明rs2070045以及它們的標(biāo)記遺傳變異導(dǎo)致歐洲人群的晚發(fā)性阿爾茨海默病(late-onset AD,LOAD)風(fēng)險增加,Shen等[12]研究證實rs2070045與AD風(fēng)險增加相關(guān)(OR=1.13,P=0.009),然而,亞組分析顯示,rs2070045與AD易感性之間的關(guān)聯(lián)在亞洲人和高加索人之間顯著不同。Louwersheimer等[13]研究表明LOAD相關(guān)的SORL1 SNP在種族群體中是不同的,rs2070045-G等位基因通常與LOAD風(fēng)險增加相關(guān),且與腦脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)中更高的tau水平和更多的海馬萎縮之間顯著關(guān)聯(lián)。然而最近兩個針對AD患者的CSF tau和p tau水平的GWAS中[14,15],未檢測到與SORL1的關(guān)聯(lián)。一項薈萃分析表明[16],rs2070045及rs3824968與AD風(fēng)險增加顯著相關(guān),rs2070045-G等位基因顯示AD風(fēng)險增加(OR=1.08,P=0.02);當(dāng)合并亞洲數(shù)據(jù),rs2070045-G等位基因攜帶者的AD風(fēng)險增加(OR=1.27,P=0.001)。亦有不同研究報道T等位基因是一種危險因素[17]。Alexopoulos等[18]研究表明rs3824968與CSF中較低的Aβ水平顯著相關(guān)。其A等位基因可影響人腦區(qū)域(如小腦、顳葉皮質(zhì)組織和殼核)的SORL1表達(dá)[11],Huang等[19]發(fā)現(xiàn)攜帶SORL1 rs3824968等位基因A與右后扣帶、左中枕、內(nèi)側(cè)額葉和上顳回中表現(xiàn)出較小的灰質(zhì)體積有關(guān),SORL1之間的相互作用提高了等位基因A對殼核的有害和加速的老化效應(yīng)。亦有學(xué)者研究認(rèn)為T等位基因與嚴(yán)重海馬萎縮相關(guān)(P<0.05)[13]。在中國人群中的兩項研究[20,21]也報道了SORL1 rs3824968 A等位基因與AD風(fēng)險增加有關(guān),然而Shen等[12]研究表明沒有足夠的證據(jù)表明,rs3824968與AD之間存在顯著相關(guān)性,亞組分析表明亞洲人的rs3824968與AD風(fēng)險增加有關(guān)。

綜上所述,SORL1 rs2070045、rs3824968與AD之間的關(guān)聯(lián)在不同人群中并不一致,在不同種族的研究結(jié)果亦不一致。關(guān)于SORL1研究中,不同結(jié)果的可能潛在原因是AD病因非常復(fù)雜,多個不同的致病變異發(fā)生在SORL1的多個結(jié)構(gòu)域(等位基因異質(zhì)性),或者SORL1中遺傳變異對AD風(fēng)險的影響不足以在現(xiàn)有的數(shù)據(jù)中檢測到,但是SORL1變體在APP代謝中的作用可能影響AD病理改變。此外,AD中SORL1變體之間關(guān)聯(lián)性分析顯示rs2070045和rs382496位點在亞洲數(shù)據(jù)集[20,22]中與AD風(fēng)險相關(guān),不幸的是,我們沒有進(jìn)行rs2070045、rs3824968位點單體型分析與AD危險度關(guān)聯(lián)分析,因此無法驗證SNP rs2070045及rs3824968與AD無關(guān)。我們懷疑SORL1 rs2070045及rs3824968可能與AD風(fēng)險增加相關(guān),并且基因連鎖不平衡中存在關(guān)聯(lián)趨勢,換句話說,SORL1的SNP之間可能存在相互作用。此外,我們應(yīng)該考慮地域因素是導(dǎo)致不同結(jié)果的可能原因,其他研究人群主要是關(guān)于南方的中國人口,但我們的研究是關(guān)于中國西北的。由于我們研究樣本量相對較少,可能尚不能充分體現(xiàn)新疆哈薩克族及漢族人群整體基因分布情況,對于我們的結(jié)果有所限制。在人群篩選方面,目前AD診斷仍以癥狀為主,診斷標(biāo)準(zhǔn)以各類心理學(xué)檢測評分作參考,難免存在評分上的主觀性造成誤差;或者新疆漢族及哈薩克族人群AD可能與SORL1基因rs2070045位點及rs3824968位點多態(tài)性確實無關(guān)聯(lián)。

總的來說,這是新疆首次在漢族和哈薩克族人中進(jìn)行的SORL1基因研究,我們研究顯示SORL1基因rs2070045及rs3824968位點可能與新疆哈薩克族及漢族AD均無明顯相關(guān)。SORL1基因變異與AD易感性之間的關(guān)聯(lián)因不同種族人群而異,各民族研究結(jié)果并不一致,目前仍需提供大樣本研究進(jìn)一步驗證,為AD早期診斷提供一定的依據(jù)。