王 斌,張志敏,宋 揚,何 軒,金 豐,王 閣,李 建

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤中心,重慶 400042;*通訊作者,E-mail:lmno051049@126.com)

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,研究膀胱癌細胞關(guān)鍵分子的作用機制,對深入了解膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程及分子靶向治療具有重要的臨床意義[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA,可與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)區(qū)結(jié)合,促進靶基因mRNA的降解或者導(dǎo)致其沉默,進而抑制靶基因的表達[2]。miRNA在腫瘤特別是膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用,研究miRNA在膀胱癌中的作用機制,對膀胱癌的診斷、治療及判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義[3]。miR-8085在疾病中的作用報道研究很少。本研究通過檢測miR-8085在膀胱癌組織中的表達及過表達人膀胱癌J82細胞中miR-8085的表達為模型,分析miR-8085在膀胱癌細胞中的作用機制,為膀胱癌的分子診斷標志物和靶向治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源

來源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心2016-08～2018-02手術(shù)切除的32例膀胱癌和癌旁正常組織樣本,手術(shù)切下的樣本迅速凍存于液氮保存,術(shù)后病理均證實為膀胱癌。本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署了知情同意書。

1.2 細胞株和主要試劑

人膀胱癌細胞株J82購于上海信然生物技術(shù)有限公司。陰性對照慢病毒、攜帶miR-8085的慢病毒、miR-NC和miR-8085模擬物購于上海吉瑪公司;實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;Transwell小室購于美國Corning公司;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖匈徲诿绹鳳romega公司;野生型與突變型TOP2A 3′非翻譯區(qū)熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL-4載體)購于南京諾唯贊生物科技有限公司;Lipofectamine?3000和基質(zhì)膠購于美國Life Technologies公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;一抗N-cadherin、TOP2A、GAPDH、CDK4、Twist1及Cyclin B和二抗羊抗兔購于美國Abcam公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和感染

人膀胱癌細胞株J82培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的J82細胞接種于6孔板,待細胞匯合度為60%-70%時,分別感染攜帶miR-8085的慢病毒和陰性對照慢病毒,命名為實驗組和對照組。感染操作依據(jù)慢病毒感染說明書嚴格操作。感染后第8-12小時觀察J82細胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測miR-8085和TOP2A的表達量

應(yīng)用Trizol法提取組織和細胞中總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR試劑盒擴增檢測組織和細胞中miR-8085或TOP2A的表達量。qPCR擴增參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,62 ℃退火17 s,72 ℃延伸17 s,共36個循環(huán)。qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理。分別以U6和GAPDH作內(nèi)參,計算miR-8085和TOP2A的表達量。引物序列如下,GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;miR-8085上游引物:5′-GGGTGGGAGAGAGGACTG-3′,下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;TOP2A上游引物:5′-TGGCTGTGGTATTGTAGAAAGC-3′,下游引物5′-TTGGCATCATCGAGTTTGGGA-3′。

1.5 Transwell侵襲實驗檢測感染J82細胞的侵襲能力

收集兩組感染細胞,使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2.5×105個/ml?；|(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室上室,37 ℃凝固30 min。在Tran-swell小室上室加入200 μl/孔細胞懸液,在Transwell小室下室加入650 μl/孔含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱。連續(xù)培養(yǎng)1 d,使用多聚甲醛固定18 min,使用結(jié)晶紫染液染色18 min,使用流水輕輕沖洗,使用棉簽輕輕擦去未穿過底膜的細胞。室溫下晾干后,使用顯微鏡計數(shù)穿過底膜的細胞數(shù),每孔隨機選4個視野計數(shù),取平均數(shù)并統(tǒng)計分析。

1.6 MTT法檢測感染J82細胞的增殖能力

收集兩組感染細胞,使用培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度,以每孔3 000個接種于96孔板,加入200 μl/孔培養(yǎng)基。分別于接種后第1,2,3,4,5天檢測每孔細胞的吸光度(A)值。每孔加入MTT試劑20 μl,使其終濃度達到5 mg/ml,在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h;4 h后吸去上清,加入200 μl/孔二甲基亞砜,在搖床充分振蕩,促進結(jié)晶溶解。采用酶標儀檢測波長495 nm處每孔的吸光度(A)值。

1.7 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-8085的靶基因

使用生物信息學(xué)預(yù)測軟件OncomiR、RegRNA2.0、starbase v2.0和PICTAR2預(yù)測miR-8085可能的靶基因。TOP2A 3′UTR-MUT為突變型TOP2A 3′非翻譯區(qū)質(zhì)粒,TOP2A 3′UTR-WT為野生型TOP2A 3′非翻譯區(qū)質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的J82細胞接種于6孔板,細胞匯合度為40%-60%時,將miR-8085模擬物或miR-NC分別和TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至J82細胞,轉(zhuǎn)染嚴格依據(jù)Lipofectamine?3000說明書操作。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖袡z測每組J82細胞的螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性,采用“螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性”表示每組J82細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測靶基因的表達

收集兩組感染細胞并提取總蛋白,每組分別提取30 μg蛋白溶液,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳1.5 h,電轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜,5%脫脂牛奶配成的封閉液封閉3 h。在4 ℃搖床上,分別孵育CDK4(稀釋比為1 ∶1 000)、TOP2A(稀釋比為1 ∶2 000)、Cyclin B(稀釋比為1 ∶3 000)、Twist1(稀釋比為1 ∶500)、N-cadherin(稀釋比為1 ∶500)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶1 000)。一抗孵育12 h,加入對應(yīng)的二抗羊抗兔,室溫下孵育2 h。加入超敏ECL發(fā)光試劑,應(yīng)用凝膠成像儀顯影、拍照、分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中miR-8085的表達

qPCR結(jié)果顯示,32例膀胱癌組織和癌旁組織中miR-8085的相對表達量分別為2.50±0.78和7.35±0.92,癌旁組織miR-8085的相對表達量是膀胱癌組織的2.94倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.94,P<0.01,見圖1)。

與癌旁組織比較,**P<0.01圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中miR-8085的相對表達量Figure 1 Expression of miR-8085 in bladder cancer tissue and paracancerous tissue

2.2 J82細胞感染miR-8085病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對照組和實驗組細胞中miR-8085的相對表達量分別為1.08±0.25和9.69±1.05,實驗組miR-8085的相對表達量是對照組的8.97倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.99,P<0.01,見圖2)。

與對照組比較,**P<0.01圖2 對照組和實驗組J82細胞中miR-8085的相對表達量Figure 2 Expression of miR-8085 in J82 cells in control group and experimental group

2.3 miR-8085對J82細胞侵襲能力的影響

對照組和實驗組細胞中穿膜J82細胞數(shù)分別為82.63±7.60和35.45±11.27個。與對照組比較,實驗組穿膜J82細胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.47,P<0.05,見圖3),miR-8085具有抑制膀胱癌J82細胞侵襲的能力。

與對照組相比,*P<0.05圖3 miR-8085對J82細胞侵襲能力的影響Figure 3 Effect of miR-8085 on the invasion ability of J82 cells

2.4 miR-8085對J82細胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實驗組J82細胞在感染后第3,4,5天的A值低于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.90,P<0.05;t=4.54,P<0.05;t=5.79,P<0.01),表明miR-8085具有抑制膀胱癌J82細胞增殖的能力。在第1,2天的A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為0.09,1.73,均P>0.05,見圖4)。

2.5 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda分析,miR-8085的靶基因可能是TOP2A,結(jié)合區(qū)域序列見圖5。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 miR-8085對J82細胞增殖能力的影響Figure 4 Effect of miR-8085 on the proliferation of J82 cells

圖5 miR-8085與TOP2A 3′-UTR結(jié)合區(qū)域的序列Figure 5 Sequence of the binding region of miR-8085 and TOP2A 3′-UTR

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-8085靶向結(jié)合TOP2A

TOP2A 3′UTR-WT核心序列為“UCUCCCA”,TOP2A 3′UTR-MUT突變序列為“AGAGGGU”。分別將miR-8085模擬物或miR-NC與TOP2A 3′UTR-MUT或TOP2A 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染至J82細胞中,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測相對熒光素酶活性。miR-8085與TOP2A 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染可有效降低相對熒光素酶活性(t=12.75,P<0.01),miR-8085與TOP2A 3′UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染對相對熒光素酶活性無明顯作用,表明miR-8085可直接靶向結(jié)合TOP2A基因(見圖6)。

2.7 J82細胞感染miR-8085慢病毒對TOP2A mRNA表達的影響

qPCR結(jié)果顯示,感染miR-8085慢病毒后的實驗組J82細胞中TOP2A mRNA的相對表達量(0.20±0.03)明顯低于對照組(1.01±0.09),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.79,P<0.01),表明miR-8085可有效抑制TOP2A mRNA的相對表達。

1.miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT;2.miR-8085+TOP2A 3′UTR-WT;3.miR-NC+TOP2A 3′UTR-MUT;4.miR-NC+TOP2A 3′UTR-WT;與miR-8085+TOP2A 3′UTR-MUT比較,**P<0.01圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-8085靶向結(jié)合TOP2AFigure 6 Verification of the binding of miR-8085 to TOP2A by dual luciferase reporter assay

2.8 TOP2A蛋白、侵襲與增殖相關(guān)蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果表明,感染miR-8085慢病毒后的實驗組J82細胞中,TOP2A蛋白表達量明顯降低,細胞侵襲相關(guān)蛋白Twist1蛋白以及N-cadherin蛋白表達明顯減少,細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin B蛋白以及CDK4蛋白表達減少(見圖7)。

圖7 miR-8085對TOP2A蛋白及相關(guān)蛋白表達的影響Figure 7 Effect of miR-8085 on the expression of TOP2A protein and related proteins

3 討論

微小RNA(miRNA)由19-25個核苷酸構(gòu)成,通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,參與細胞增殖、分化、凋亡、衰老、轉(zhuǎn)移等各種生物學(xué)行為[4,5]。越來越多的研究表明,miRNA在膀胱癌的的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,miRNA機制研究已成為膀胱癌研究領(lǐng)域的重點[6,7]。如miR-497[8]、miR-139-5p[9]、miR-608[10]等miRNA在膀胱癌組織中的表達量明顯減少,可顯著抑制膀胱癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移。如miR-556-3p[11]、miR-495[12]在膀胱癌組織中的表達量明顯增加,可顯著促進膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移和增殖。miR-8085是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,關(guān)于miR-8085的研究未見報道。miR-8085在膀胱癌中表達情況及其作用機制尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示,miR-8085在膀胱癌組織中的表達顯著少于癌旁組織,miR-8085可能參與抑制膀胱癌的生長。為了進一步研究miR-8085對膀胱癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響,本研究以載有miR-8085的慢病毒感染膀胱癌J82細胞為研究對象,通過Transwell侵襲實驗和MTT法分析過表達miR-8085后,J82細胞侵襲和增殖能力的改變。與陰性對照慢病毒相比,miR-8085慢病毒可顯著抑制膀胱癌J82細胞的侵襲能力和增殖能力,miR-8085具有抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移和生長的作用。

miRNA主要通過抑制靶基因的表達,參與調(diào)控細胞的生物學(xué)功能[13]。本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件miRNAMap、miRDB、RNAhybrid及miRanda預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-8085可能的靶基因拓撲異構(gòu)酶IIα(TOP2A)。TOP2A參與構(gòu)成核基質(zhì),通過參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、基因重組等過程,影響細胞生物學(xué)行為[14]。TOP2A在正常細胞和組織中表達呈低水平狀態(tài),前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中表達明顯增加,參與腫瘤細胞的分化、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等[15,16]。TOP2A在腫瘤的增殖和侵襲可能具有明顯的促進作用[16]。有研究表明,TOP2A在膀胱癌中的表達明顯增加,且與膀胱癌患者的TNM分期和不良預(yù)后明顯相關(guān)[17]。因而,通過抑制TOP2A的表達,可能具有抑制膀胱癌生長和轉(zhuǎn)移的作用。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn),miR-8085可直接靶向結(jié)合TOP2A mRNA的3′UTR區(qū)域。qPCR和Western blot結(jié)果進一步顯示,過表達miR-8085在mRNA和蛋白水平上均可抑制TOP2A的表達。降低TOP2A蛋白的表達后,細胞侵襲相關(guān)蛋白Twist1和N-cadherin蛋白表達明顯降低,細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin B和CDK4蛋白表達明顯降低,表明細胞侵襲能力和增殖能力受到明顯抑制。miR-8085是通過降低TOP2A基因的表達,參與抑制膀胱癌細胞的侵襲和增殖能力。

本研究確定了miR-8085和TOP2A的靶向調(diào)控關(guān)系,miR-8085可通過靶向抑制TOP2A基因的表達,抑制膀胱癌細胞的侵襲和增殖能力,為進一步研究miR-8085和TOP2A在膀胱癌生長和轉(zhuǎn)移的中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。