張 明,吳 媛,趙永林,趙君杰,黃廷欽,馬旭東,宋錦寧*

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710004;2西安交通大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科;3西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤病院;4西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:jinnings@126.com)

腦卒中是導致老齡人群致殘和死亡的重要原因,其中約80%患者為缺血性卒中。缺血性腦損傷是影響患者遠期預后的主要原因[1],一旦缺血開始形成,在數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)就會發(fā)生序貫性加重的腦損傷,缺血導致相關(guān)區(qū)域神經(jīng)血管單元功能受到嚴重影響,尤其是神經(jīng)元處于高代謝狀態(tài),在缺血影響下導致細胞內(nèi)外能量代謝失衡,在此過程中神經(jīng)元細胞更易受到損害,引起細胞信號傳導異常,除引起興奮性毒性外[1],還有可能產(chǎn)生因Ca2+超載導致的非興奮性毒性機制。近年來,有研究認為Ca2+可通透性瞬時受體電位通道1(transient receptor potential channel 1,TRPC1)是非興奮性毒性機制相關(guān)蛋白[2]。體內(nèi)實驗表明,敲除小鼠海馬神經(jīng)元的TRPC1,可明顯減少動作電位誘發(fā)的興奮性突觸后電流,對突觸傳遞產(chǎn)生影響[2]。進一步的研究證實[3],TRPC1缺失可能通過擾亂多種生物過程引起紋狀體神經(jīng)細胞凋亡,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、氧化應激和凋亡相關(guān)信號通路,TRPC1可能是調(diào)節(jié)小鼠紋狀體細胞存活和死亡的關(guān)鍵參與者。但TRPC1在腦缺血后神經(jīng)元中的表達變化如何,是否與腦缺血后鈣超載導致的神經(jīng)元凋亡相關(guān),抑制TRPC1引起的鈣內(nèi)流是否對腦缺血后神經(jīng)元起到保護作用,目前具體的作用機制尚不明確。因此,本研究采用四血管阻塞法建立大鼠腦缺血模型,探討TRPC1離子通道在缺血后神經(jīng)元鈣超載中的作用,以揭示TRPC1通道參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡及突觸損傷的機制,尋找臨床治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

6周齡雄性SD大鼠120只,SPF級,體質(zhì)量220-260 g,由西安交通大學動物實驗中心提供(許可證號:SCXK(陜)08-018)。SKF96365(S7809,Sigma-Aldrich,美國);二甲基亞砜溶液(DMSO,D8418,Sigma-Aldrich,美國);細胞膜蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific,美國);NeuN(Chemicon,MAB377B,美國)TRPC1兔單克隆抗體(Abcam,美國);β-actin鼠單克隆抗體(Santa Cruz,美國);辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(Santa Cruz,美國);PVDF膜(Millipore,美國);TUNEL凋亡試劑盒(Promega,美國);凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A,中國);圖像采集與分析系統(tǒng)(Leica-Q550CW,德國);透射式電子顯微鏡(H-600型,日本);腦立體定向儀(Stoelting Ultra Precise 51600,美國)。

1.2 大鼠分組處理及全腦缺血模型的建立

120只SD大鼠被隨機分為腦缺血模型組(n=50),SKF96365干預模型組(n=50),DMSO干預對照模型組(n=10),正常對照組(n=10)。腦缺血模型組及SKF96365干預模型組各分為5個亞組,分別為缺血后1 d,3 d,5 d,7 d,10 d組,每組10只。

大鼠術(shù)前禁食禁飲4-6 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉。頸前部剃毛備皮,常規(guī)消毒,暴露雙側(cè)頸總動脈,分離并完全結(jié)扎雙側(cè)鎖骨下動脈。當大鼠翻正反射將要恢復,即有翻身動作但尚不能翻身時,迅速用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈,使大腦血供完全消失,可見大鼠掙扎數(shù)秒后于60 s內(nèi)昏迷,同時可見大鼠四肢上舉,痛覺反射消失,反正反射消失,雙側(cè)瞳孔散大,眼球呈灰白色,計時15 min,放開動脈夾迅速縫合傷口。大鼠置于恒溫箱中進行術(shù)后恢復。SKF96365干預模型組將5 μl TRPC1阻斷劑SKF96365溶于DMSO,終濃度為10 μmol/L,于建模前30 min經(jīng)立體定向側(cè)腦室微注射(前囟后1 mm,旁開1.5 mm,深3.5 mm);DMSO干預對照模型組使用等量DMSO行側(cè)腦室注射,其他操作與全腦缺血模型組相同。正常對照組不予任何處理。

1.3 免疫形態(tài)學及電鏡研究

各組大鼠在缺血后1,3,5,7,10 d分別進行形態(tài)學標本采集[4]。10%水合氯醛以0.5 ml/kg麻醉,用40 g/L的多聚甲醛灌流固定。石蠟包埋并制成5 μm切片,經(jīng)烘片、脫蠟、梯度酒精脫水及抗原修復后,滴加封閉血清,在濕盒中37 ℃封閉30 min。滴加適宜濃度的一抗置濕盒中37 ℃ 1 h,再洗去一抗,滴加熒光二抗,室溫濕盒中避光孵育1 h,洗二抗后滴加DAPI,之后用甘油封片,在熒光顯微鏡下立即觀察并采集圖像。采用SABC法進行組織化學染色并在光鏡下進行觀察。將海馬標本用電鏡固定液固定,采用常規(guī)電鏡標本制作方法,經(jīng)清洗、脫水、浸透、包埋和修塊后作超薄切片,在透射電鏡下觀察。

1.4 海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)檢測

取新鮮海馬剪碎后置于1.5 ml冰Hank’s液中,吹打10 min,過200目濾網(wǎng)。用含100 ml/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液(106個/ml)。取細胞懸液1 ml離心,棄上清,37 ℃預溫后加入7.5 μl的Fura-2AM(終濃度為6 μmol/L);另取同一細胞懸液1 ml未負載Fura-2AM作為空白對照。單細胞懸液37 ℃復溫后在流式細胞儀上檢測熒光強度[4,5]。激發(fā)波長為380 nm,發(fā)射波長為510 nm,分別測定F、Fmax、Fmin。F為380 nm激發(fā)波長測得的熒光強度值;Fmax為最大熒光強度值,即加入Triton X-100(終質(zhì)量濃度為1 nmol/L)后所測得的熒光強度值;Fmin為最小熒光強度值,即在Fmax基礎(chǔ)上加入EGTA(終濃度為5 nmol/L)后所測得的熒光強度值。胞內(nèi)Ca2+濃度計算:[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),其中Kd=224 nmol/L。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

各組大鼠在缺血后1,3,5,7,10 d分別進行蛋白印跡標本采集[6]。灌注取腦,取雙側(cè)海馬,用提取細胞膜蛋白試劑盒,用BCA法進行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品,SDS-PAGE分離蛋白,半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將膜放入50 g/L脫脂牛奶中37 ℃封閉后,加入一抗(TRPC1,1 ∶1 000;NeuN,1 ∶500;β-actin,1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜,加辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,用增強化學放光法觀察顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍照,用Image J軟件測定條帶吸光度作定量分析。

1.6 TUNEL檢測皮層神經(jīng)元凋亡

腦缺血模型組、SKF96365干預模型組、DMSO干預對照模型組各3只大鼠在預定的時間點深度麻醉后,經(jīng)左心室灌注固定后迅速開顱取腦,40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)冠狀切片,每個腦塊10張,片厚5 μm。按照TUNEL凋亡試劑盒提供步驟染色。圖像分析系統(tǒng)采集圖像,每張切片隨機選取5個視野(100-200倍),計數(shù)TUNEL陽性神經(jīng)元[7]。

1.7 Morris水迷宮實驗(Morris water maze,MWM)

連續(xù)4 d對大鼠進行4次學習獲得試驗。試驗持續(xù)時間最長為120 s,在此時間范圍內(nèi)未能找到平臺的大鼠被實驗者輕輕引導至平臺。大鼠在連續(xù)4 d學習后,建立全腦缺血模型。干預模型組大鼠在誘導腦缺血前30 min接受側(cè)腦室顯微注射SKF96365。第1-10天在探索試驗中測試腦缺血模型組和SKF96365干預模型組中的大鼠。記錄大鼠在訓練象限中搜索平臺的時間比例,即平臺的先前位置,并用作空間記憶保持的量度,以確定每組中搜索目標象限的差異[8]。

1.8 體視學分析

每個腦塊以100 μm厚度垂直于長軸連續(xù)切割,并且沿著海馬整個范圍收集冠狀切片。隨機選擇5個系列切片用于染色,使用系統(tǒng)均勻隨機采樣[9]。單個實驗者在不知道每只大鼠條件的情況下收集該研究的所有體視學數(shù)據(jù)。使用基于計算機的Stereologer TM(SPA,Alexandria,VA)系統(tǒng)輔助的光學技術(shù)評估海馬CA1區(qū)域中錐體神經(jīng)元的總數(shù)[10]。用以下等式[11]計算錐體神經(jīng)元的數(shù)量:N=(1/ssf)(1/asf)(1/tsf)ΣQ-,其中N是錐體神經(jīng)元總數(shù)的估計值,并且ΣQ-是整個參考空間中計數(shù)的單元格數(shù)。ssf是截面采樣分數(shù),asf是面積采樣分數(shù),tsf是截面厚度分數(shù)。為了評估神經(jīng)元數(shù)量和密度的可能差異,按照公式計算海馬結(jié)構(gòu)亞區(qū)神經(jīng)元的總數(shù)目。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元[Ca2+]i變化

腦缺血模型組中海馬神經(jīng)元[Ca2+]i在缺血后3 d時明顯升高,之后逐漸降低,至10 d時降至1 d水平。SKF96365干預模型組中海馬神經(jīng)元[Ca2+]i雖在1 d開始上升,高于正常對照組,但其總體升高趨勢被明顯抑制,與腦缺血模型組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與正常對照組相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖1 不同時間段海馬神經(jīng)元[Ca2+]i變化趨勢Figure 1 Changes of [Ca2+]i in hippocampal neurons at different time points

2.2 海馬神經(jīng)元形態(tài)學變化

神經(jīng)元特異性NeuN熒光染色可見正常對照組大鼠海馬結(jié)構(gòu)完整,CA1區(qū)神經(jīng)元細胞熒光強度正常,腦缺血模型組海馬結(jié)構(gòu)基本保持完整,但CA1區(qū)神經(jīng)元細胞熒光顯示神經(jīng)元染色有丟失(見圖2A、B)。透射電鏡下觀察海馬超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),腦缺血模型組中神經(jīng)元腫脹,神經(jīng)元胞內(nèi)線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張,嵴紊亂,周圍可見高密度電子物質(zhì)生成,細胞核變形,部分胞質(zhì)內(nèi)空泡形成,染色質(zhì)不均勻、邊集、濃縮,可見核內(nèi)凋亡小體形成;正常組中髓鞘結(jié)構(gòu)完整,髓鞘形態(tài)連續(xù),其內(nèi)可見神經(jīng)纖維斷層;而腦缺血模型組中可見髓鞘正常結(jié)構(gòu)受到破壞,髓鞘腫脹,局部有空泡形成,髓鞘連續(xù)性片層結(jié)構(gòu)疏松、分離或消失,片層結(jié)構(gòu)內(nèi)缺乏神經(jīng)纖維及線粒體。使用SKF96365阻斷鈣內(nèi)流后可保護神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)完整,維持神經(jīng)纖維片層結(jié)構(gòu)(見圖2C-F)。

A.正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞熒光;B.全腦缺血模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞熒光;C.全腦缺血模型組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化;D.全腦缺血模型組大鼠海馬神經(jīng)元核內(nèi)凋亡小體,髓鞘結(jié)構(gòu)破壞;E.SKF96365干預模型組大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本完整;F.SKF96365干預模型組大鼠海馬髓鞘結(jié)構(gòu)保存圖2 大鼠海馬NeuN熒光染色(×50)及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)觀察(×10 000)Figure 2 NeuN fluorescent staining(×50) and neuronal ultrastructure observation in rat hippocampus(×10 000)

2.3 TRPC1在海馬中表達變化

Western blot結(jié)果顯示,TRPC1在腦缺血后3 d表達到達高峰,之后逐漸降低,10 d時表達與1 d時相似。SKF96365干預模型組中TRPC1在3 d時表達可被抑制,其表達趨勢未出現(xiàn)顯著增加(見圖3)?；叶戎捣治鲲@示腦缺血模型組3 d與其他各組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);NeuN在腦缺血后表達明顯降低,在3 d及5 d時最顯著,與其他時間段相比差異有統(tǒng)計學意義,之后逐漸升高(P<0.05)。SKF96365干預模型組中TRPC1蛋白的表達明顯被抑制,灰度分析結(jié)果顯示,各個時間段之間相比無統(tǒng)計學意義;NeuN在干預模型組中表達呈現(xiàn)逐漸增高趨勢,在5 d時達到峰值,之后逐漸降低。SKF96365干預模型組中TRPC1蛋白的表達明顯被抑制,灰度分析顯示缺血后3 d與腦缺血模型組比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與全腦缺血模型組相比,*P<0.05圖3 腦缺血模型組及SKF96365干預模型組TRPC1在大鼠海馬中的表達變化Figure 3 Expression of TRPC1 in rat hippocampus in cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group at different time points

2.4 TUNEL陽性神經(jīng)元表達及計數(shù)

TUNEL染色結(jié)果顯示,全腦缺血模型組(見圖4F-J)在1 d時已有海馬神經(jīng)元的TUNEL陽性細胞,之后逐漸增多,至5 d時最多;SKF96365干預模型組(圖4A-E)中TUNEL陽性細胞雖較正常對照組(圖4K)有增高,但其顯著增高趨勢被抑制。TUNEL陽性細胞計數(shù)表明,腦缺血模型組中缺血后3,5,7 d與SKF96365干預模型組對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。

A-E.分別為SKF96365干預1,3,5,7,10 d組;F-J.分別為全腦缺血后1,3,5,7,10 d組;K.正常對照組圖4 全腦缺血模型組及SKF96365干預模型組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞表達變化Figure 4 Expression of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 area of cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group

與正常對照組相比,*P<0.05;與腦缺血模型相比,#P<0.05圖5 三組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)比較Figure 5 Comparison of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 area among three groups

2.5 Morris水迷宮檢測海馬功能

空間搜索實驗結(jié)果表明,正常對照組大鼠運動軌跡以目標象限居多;全腦缺血模型組大鼠運動軌跡,目標象限較少;SKF96365干預模型組大鼠運動軌跡目標象限較腦缺血模型組增多(見圖6)。全腦缺血模型組與正常對照組相比,大鼠空間搜索目標象限的軌跡時間明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而SKF96365干預模型組與全腦缺血模型組相比,大鼠空間搜索目標象限的軌跡雖未能恢復至正常,但空間目標搜索時間明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。

2.6 體視學分析結(jié)果

大鼠海馬CA1區(qū)不同視野下陽性NeuN神經(jīng)元計數(shù)數(shù)量在腦缺血模型組中,5 d時為最少,之后逐漸升高;而SKF96365干預模型組的陽性NeuN神經(jīng)元計數(shù)數(shù)量在5 d時與腦缺血模型組相比,數(shù)量明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7),說明存活神經(jīng)元數(shù)量較全腦缺血組改善。

與正常對照相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖6 正常對照組、全腦缺血模型組和SKF96365干預模型組大鼠在水迷宮中的運動軌跡及目標象限耗時Figure 6 The trace and target quadrant time consuming of rats in normal group, cerebral ischemia model group and SKF96365 intervention model group in water maze

與正常對照組相比,*P<0.05;與全腦缺血模型組相比,#P<0.05圖7 體視學分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及陽性NeuN神經(jīng)元數(shù)量Figure 7 Stereology analysis of the number of neurons in hippocampal CA1 area and the number of positive-NeuN neurons

3 討論

本研究形態(tài)學研究觀察到,腦缺血后的海馬可見腫脹的神經(jīng)元、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng),神經(jīng)髓鞘正常結(jié)構(gòu)減少或消失,可見部分核內(nèi)凋亡小體,TUNEL細胞凋亡檢測可見缺血后海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加,MWM實驗觀察到大鼠長時程的記憶障礙,這與Pulsinelli經(jīng)典四血管阻塞法建立全腦缺血模型后的海馬神經(jīng)元的表現(xiàn)相一致,說明本研究改良模型可較好模擬人腦缺血后的病理生理狀態(tài),利用此方法建立大鼠短暫性全腦缺血模型是可行且可靠的。

Ca2+是神經(jīng)元最普遍的信號轉(zhuǎn)導分子,而鈣超載是腦缺血后導致細胞損傷最重要的一類離子失衡。近年有研究認為,位于細胞膜上的六次跨膜蛋白TRPC離子通道開放可通透Ca2+[12]。而TRPC1是其中一類陽離子非選擇性鈣可通透通道,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細胞膜上均有表達,可單獨參與調(diào)控鈣內(nèi)流[12],亦可參與增殖和存活、分化、分泌和細胞遷移等功能[13]。TRPC1同聚體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可形成有功能的離子通道,受胞內(nèi)IP3水平的調(diào)控,參與鈣池Ca2+釋放[14]。

本研究觀察到,TRPC1可在大鼠海馬組織中廣泛表達,主要表達在海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)及CA3區(qū),腦缺血后早期海馬神經(jīng)元中TRPC1的表達有一過性升高,在3 d時達到峰值,之后逐漸下降,而神經(jīng)元中[Ca2+]i亦在3 d時到達高峰,神經(jīng)功能評分及MWM實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦缺血模型建立后,大鼠海馬功能受損隨時間逐漸加重,到3-5 d時學習記憶障礙明顯加重,說明TRPC1不僅參與了腦缺血后神經(jīng)元中的鈣超載,而且可能是神經(jīng)突觸功能損傷的原因之一。本研究通過體視學分析觀察到,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量隨著腦缺血的時間推移而逐漸減少,在第5天時海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量達到最低,神經(jīng)元特異性表達的NeuN陽性細胞數(shù)亦到最低,之后緩慢恢復,進一步通過TUNEL檢測到神經(jīng)元細胞損傷在3 d時開始形成,凋亡神經(jīng)元數(shù)量逐漸升高,在7 d時最多,提示TRPC1引起的鈣超載可能觸發(fā)了神經(jīng)元的凋亡機制,引起細胞遲發(fā)性序貫凋亡。

SKF96365是TRPC1離子通道的阻斷劑之一[15],可抑制TRPC1離子通道的活性,減少Ca2+內(nèi)流,在體外研究中被廣泛應用[16],本研究中通過立體定向微注射的方式將SKF96365注入側(cè)腦室,大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元的數(shù)量在第3,5,7天顯著降低,這表明在缺血后抑制Ca2+內(nèi)流會有更多神經(jīng)元可得到存活。MWM實驗表明,Ca2+內(nèi)流減少可部分改善大鼠空間搜索的能力。進一步通過體視學分析發(fā)現(xiàn),SKF96365干預模型組神經(jīng)元數(shù)量在第5天時明顯較腦缺血組升高,這說明,海馬神經(jīng)元可通過減少Ca2+內(nèi)流而得到存活,突觸功能可通過抑制TRPC1介導的Ca2+內(nèi)流而得到改善。這與文獻報道的結(jié)果相類似[17]。因此,缺血后TRPC1介導Ca2+內(nèi)流可能是導致大鼠海馬CA1區(qū)突觸功能受損的重要原因,而腦缺血后表達升高的TRPC1可能在大鼠遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中扮演關(guān)鍵角色。

本研究功能學實驗結(jié)果表明,在缺血后阻斷過度Ca2+內(nèi)流可改善海馬學習記憶功能,這與TRPC1依賴性的鈣庫操控性鈣內(nèi)流在亨廷頓病小鼠模型中可影響突觸穩(wěn)定性及運動表現(xiàn)[18]相一致。文獻報道,TRPC1負性調(diào)控和通道的激活還可能通過阻斷小膠質(zhì)細胞炎癥通路的啟動而發(fā)揮免疫抑制活性[19],而TRPC1的缺乏還可能通過增強Nox4衍生的活性氧生成來加劇腦缺血/再灌注誘導的神經(jīng)損傷[20],同時亦可通過NF-κB介導的TRPC1表達調(diào)控自噬來誘導細胞死亡[21]。但有文獻指出TRPC1蛋白缺失可導致小鼠紋狀體神經(jīng)元細胞凋亡以及相關(guān)蛋白質(zhì)組學改變[3],因此,TRPC1在神經(jīng)元細胞中的作用仍需深入研究。

綜上所述,本研究表明,腦缺血后大鼠海馬高表達的TRPC1在鈣超載中扮演重要角色,在此過程中,過度Ca2+內(nèi)流可被高表達的TRPC1所誘導,從而觸發(fā)神經(jīng)元死亡的許多下游機制,TRPC1可作為腦缺血后的非興奮性中毒機制而在突觸損傷中起關(guān)鍵作用。