劉 飛,吳甜甜,張千千,郭青玉

(西安交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院陜西省牙頜疾病臨床研究中心,西安 710004;*通訊作者,E-mail:guoqinyu@mail.xjtu.edu.cn)

氟化物廣泛存在于自然界的水、空氣、巖石和土壤中,也被添加至牙膏、漱口水中,過量攝入氟化物會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性[1]。急性氟中毒最常見的癥狀有胃腸道反應(yīng),包括胃痛、惡心、嘔吐、胃腸道出血以及肌肉痙攣等。慢性氟中毒多表現(xiàn)為氟斑牙(dental fluorosis)、氟骨癥(skeletal fluorosis)以及一些非骨相器官的損傷[2]。在高氟飲水地區(qū)居住10年以上的居民多患有氟斑牙;每天飲水?dāng)z氟量超過0.2 mg/kg,氟化物沉積于骨組織,形成氟骨癥,導(dǎo)致骨骼脆性增加、強(qiáng)度下降。

飲水中的氟化物是人和動(dòng)物攝入氟最普遍的方式,占攝入總氟量的60%。飲水中的氟更容易被機(jī)體吸收,經(jīng)口攝入的氟化物被胃腸吸收的吸收率約為80%-97%。流行病學(xué)調(diào)查顯示,在高氟飲水區(qū)生活超過20年的居民出現(xiàn)背部疼痛、關(guān)節(jié)炎及膝部疼痛等。Namkaew等[3]對(duì)泰國清邁省的Poo-kha和On-tai兩個(gè)地區(qū)的飲用水含氟濃度與居民慢性疼痛癥狀之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系的回顧性研究發(fā)現(xiàn),534名年齡大于50歲的當(dāng)?shù)鼐用翊嬖诼蕴弁?尤其是腰背部的疼痛,與每日飲用水中的含氟量存在明顯的相關(guān)性。此外,使用氟化物治療骨質(zhì)疏松患者時(shí),會(huì)出現(xiàn)顯著的下肢疼痛副反應(yīng)[4,5]。

本研究給予幼年小鼠高濃度的氟化物飲水,模擬自然條件下含氟飲水地區(qū)的生活環(huán)境,在成年后測(cè)量小鼠的基礎(chǔ)痛閾,為闡明氟化物所致疼痛癥狀的機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

錄像追蹤系統(tǒng)(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain);Von Frey纖維絲(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA);熱板儀(RB-200,成都泰盟科技有限公司);氟化鈉(分析純,天津市恒興化學(xué)試劑制藥有限公司);甲醛溶液(分析純,南京化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡雄性C57/BL小鼠24只,體質(zhì)量(14±2)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供(SPF級(jí),動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(陜2012-003))。小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組12只。飼養(yǎng)室溫(22±1)℃;日光燈采光,光暗周期12 ∶12;每4只在同籠飼養(yǎng),自由采食和飲水,每周更換消毒墊料1次。

1.3 飲用水加氟處理

除小鼠的飲水外,其余飼養(yǎng)條件均完全一致。按飲用水中是否添加氟化物將小鼠分為:對(duì)照組,飲用蒸餾水;實(shí)驗(yàn)組,飲用100 mg/L的氟化鈉溶液。飲水加氟的時(shí)間持續(xù)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期,即鼠齡4-10周,共計(jì)6周。

1.4 一般狀況及體質(zhì)量

在小鼠4周齡至10周齡之間,每周周末稱取并記錄各組小鼠的體質(zhì)量,同時(shí)觀察各組小鼠的牙齒、皮毛、精神狀態(tài)和反應(yīng)靈敏度等體征。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)

將小鼠置于45 cm×45 cm×45 cm的曠場(chǎng)測(cè)試箱中,使用錄像追蹤系統(tǒng)(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain)記錄小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后的前10 min及總60 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)路程。

1.6 Von Frey纖維絲實(shí)驗(yàn)

由小鼠4周齡起,每周使用Von Frey纖維絲(North Coast Medical Inc,Morgan Hill,USA)測(cè)試其機(jī)械痛閾直至鼠齡8周,共5次。11根Von Frey纖維絲對(duì)應(yīng)的機(jī)械力值依次為0.008,0.02,0.04,0.070,0.16,0.40,0.60,1.0,1.4,2.0,4.0 g。安靜環(huán)境下,將小鼠置于半透明有機(jī)玻璃籠中,限制其過度活動(dòng)。金屬網(wǎng)格底板小孔每邊長約1 mm。測(cè)試前先讓小鼠適應(yīng)環(huán)境30 min,室溫控制在(20±2)℃。測(cè)試根據(jù)文獻(xiàn)[12,13]的方法進(jìn)行:由0.008 g纖維絲開始依次對(duì)小鼠左后爪中心處施加壓力至纖維絲呈C型,當(dāng)小鼠出現(xiàn)縮爪或甩爪時(shí)為陽性反應(yīng),每根纖維絲施力每次2 s,間隔15 s,共10次。記錄首次出現(xiàn)≥2次陽性反應(yīng)的力值作為疼痛閾值;按公式相對(duì)縮爪頻率=10次施力中總陽性反應(yīng)次數(shù)/10×100%,計(jì)算相對(duì)縮爪頻率。

祖屋占地面積將近一畝，有主人房、客廳、偏房、豆豉作坊和曬坪。每天早上豆豉作坊彌漫柴火引燃前嗆鼻的煙味，柴火引燃后散發(fā)出一陣陣木頭、樹脂、樹皮混燃的清香。金黃滾圓的黃豆蒸熟后，整個(gè)祖屋都充盈著香甜的黃豆味，經(jīng)過數(shù)道工序，豆子們變成了一顆顆黑黝黝的豆豉。小時(shí)候，我最期盼和喜愛的一道菜就是豆豉燜排骨，開胃下飯又回味無窮。

1.7 熱板實(shí)驗(yàn)(hot plate test,HPT)

鼠齡9周時(shí)進(jìn)行HPT,實(shí)驗(yàn)前5 min將熱板儀器(RB-200智能熱板儀,成都泰盟科技有限公司)預(yù)熱至設(shè)定溫度,控制室溫為(20±2)℃。將小鼠置于熱板上的玻璃罩內(nèi)密切觀察小鼠的活動(dòng)。一般情況下,大多數(shù)小鼠在熱刺激下出現(xiàn)不安狀況,如舉前肢、抬后肢、跳躍、舔咬后爪等,記錄小鼠首次跳躍或舔咬后爪出現(xiàn)的時(shí)間作為痛閾的指標(biāo),稱為潛伏期。連續(xù)測(cè)試3 d,每天3次取平均值;實(shí)驗(yàn)前熱板儀器選擇不同的預(yù)設(shè)溫度,依次為(46±1)℃,(50±1)℃,(54±1)℃;為避免小鼠燙傷,設(shè)定保護(hù)時(shí)間為30 s,若30 s內(nèi)小鼠未出現(xiàn)疼痛反應(yīng),則停止實(shí)驗(yàn)并以30 s記錄為其潛伏期。

1.8 福爾馬林實(shí)驗(yàn)(formalin test,FT)

鼠齡10周時(shí)進(jìn)行FT,實(shí)驗(yàn)開始前將小鼠放入30 cm×15 cm×15 cm的透明有機(jī)塑料玻璃測(cè)試盒框中適應(yīng)30 min。實(shí)驗(yàn)時(shí),于小鼠右后爪皮下注射5%的福爾馬林溶液50 μl,迅速將小鼠放入測(cè)試盒框中,呈45°角放置一塊鏡子于測(cè)試箱后以便觀察者更好地觀測(cè)小鼠的行為。60 min內(nèi),每10 min由兩名不知情人員觀察并記錄小鼠的舔咬爪時(shí)間及甩爪次數(shù),取平均值用于統(tǒng)計(jì)[14]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀況及體質(zhì)量

在整個(gè)飼養(yǎng)過程中,蒸餾水對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常,毛色光亮;實(shí)驗(yàn)組小鼠在給氟前期(4-6周齡)精神和行為均未見異常,進(jìn)食和飲水正常,體毛柔順;自小鼠8周齡時(shí)觀察到給氟組小鼠常蜷縮少動(dòng),皮毛略皺縮,部分小鼠切牙出現(xiàn)氟斑牙癥狀,呈淡黃色斑塊狀。兩組小鼠飼養(yǎng)前體質(zhì)量組間均衡性好,給氟飼養(yǎng)后,體質(zhì)量增長無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見圖1)。

圖1 長期高氟飲水對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of long-term high fluoride in drinking water on body weight of mice

2.2 長期高氟飲水對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離的影響

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中,前10 min及總60 min內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)路程兩組小鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖2)。

2.3 長期高氟飲水對(duì)小鼠機(jī)械刺激痛的影響

在Von Frey纖維絲實(shí)驗(yàn)中對(duì)鼠齡4-8周中疼痛閾值的監(jiān)測(cè)可見,對(duì)照組小鼠的痛閾未發(fā)生明顯變化,曲線平緩;實(shí)驗(yàn)組小鼠痛閾呈下降趨勢(shì)。在鼠齡7周和8周時(shí),實(shí)驗(yàn)組小鼠痛閾顯著低于對(duì)照組小鼠,且兩組小鼠的痛閾整體比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001,見圖3A)。

在Von Frey纖維絲實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠4-8周相對(duì)縮爪頻率的監(jiān)測(cè)可見,在鼠齡4周時(shí)兩組小鼠的相對(duì)縮爪頻率并無差異(見圖3B);5-6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠的相對(duì)縮爪頻率整體高于對(duì)照小鼠(見圖3C-D);7-8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠在多個(gè)纖維絲對(duì)應(yīng)的力值處相對(duì)縮爪頻率高于對(duì)照組小鼠,并表現(xiàn)出整體上的差異(見圖3E-F)。

A.實(shí)驗(yàn)開始后前10 min運(yùn)動(dòng)距離 B.實(shí)驗(yàn)總60 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離圖2 長期高氟飲水對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)距離的影響Figure 2 Effect of long-term high fluoride in drinking water on distance of exercise in open field test

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比疼痛閾值(P<0.001)，5周(P<0.05)、6周(P<0.05)、7周(P<0.01)、8周(P<0.001)相對(duì)縮爪頻率整體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖3 長期高氟飲水對(duì)小鼠機(jī)械刺激痛的影響Figure 3 Effect of long-term high fluoride in drinking water on mechanical pain of mice

2.4 長期高氟飲水對(duì)小鼠熱刺激痛的影響

在HPT中,兩組小鼠均可觀察到溫度依賴的潛伏期縮短現(xiàn)象,且在第1天及第3天(熱板溫度分別為46 ℃和54 ℃時(shí)),兩組小鼠的疼痛反應(yīng)潛伏期均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在HPT第2天(熱板溫度為50 ℃)時(shí),實(shí)驗(yàn)組小鼠疼痛反應(yīng)潛伏期明顯短于對(duì)照組小鼠(P<0.05,見圖4)。

2.5 長期高氟飲水對(duì)小鼠炎性刺激痛的影響

在1 h的觀察期內(nèi),實(shí)驗(yàn)組小鼠甩爪次數(shù)整體多于對(duì)照組小鼠;在早時(shí)相(0-10 min)和晚時(shí)相(20-60 min),以及40 min,50 min,60 min三個(gè)時(shí)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組小鼠甩爪次數(shù)均多于對(duì)照組小鼠,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

在1 h的觀察期內(nèi),兩組小鼠的舔咬爪時(shí)間整體比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在早時(shí)相(0-10 min)內(nèi)實(shí)驗(yàn)組小鼠的舔咬爪時(shí)間顯著長于對(duì)照組小鼠,而晚時(shí)相(20-60 min)內(nèi)兩組小鼠舔咬爪時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖5)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05圖4 長期高氟飲水對(duì)小鼠熱刺激痛的影響Figure 4 Effect of long-term high fluoride in drinking water on thermal pain of mice

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比甩爪次數(shù)整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖5 長期高氟飲水對(duì)小鼠炎性刺激痛的影響Figure 5 Effect of long-term high fluoride in drinking water on inflammation pain of mice

3 討論

本研究通過給予4周齡小鼠氟化鈉飲水,在飼養(yǎng)過程中監(jiān)測(cè)體質(zhì)量變化并進(jìn)行多次Von Frey hair實(shí)驗(yàn),在小鼠成年后進(jìn)行OFT、HPT及FT,結(jié)果表明長期高氟飲水環(huán)境會(huì)導(dǎo)致小鼠成年后對(duì)急性機(jī)械刺激痛、急性熱刺激痛以及慢性炎性疼痛的敏感性顯著增加。

本研究觀察到兩組小鼠體質(zhì)量均呈正常增長,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與Chioca等[6]的結(jié)果一致。也有學(xué)者觀察到給氟組動(dòng)物體質(zhì)量增長緩慢的同時(shí),攝食、攝水量下降,據(jù)此推測(cè)可能是由于飲食攝入量下降影響動(dòng)物體質(zhì)量增長[15]。但是在本研究中,限于條件,我們沒能精確計(jì)算動(dòng)物的攝食量,只觀察到兩組小鼠的體質(zhì)量在各個(gè)觀察點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,因此NaF對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量的影響仍需進(jìn)一步研究。

OFT可以用于檢測(cè)小鼠的自發(fā)活動(dòng)[16],本實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后的前10 min內(nèi)以及總60 min中的總運(yùn)動(dòng)路程均無顯著性差異,表明含氟飲水并未對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力產(chǎn)生影響。

有研究表明,氟化物可破壞動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)而降低小鼠的運(yùn)動(dòng)功能,原因可能為氟離子置換骨骼中羥基磷灰石的羥基,形成氟磷灰石,造成骨骼發(fā)育異常;也可能是由于氟化物抑制了與能量產(chǎn)生、傳導(dǎo)有關(guān)的酶活性,從而使肌肉功能受損所致[17]。傷害感受行為的測(cè)試大多是基于觀察動(dòng)物對(duì)痛刺激的逃避行為,因而動(dòng)物的基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)能力的改變會(huì)顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如在動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力喪失或降低的情況下得到傷害感受行為改變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果很有可能是假陽性。本實(shí)驗(yàn)中首先排除了兩組小鼠一般生長發(fā)育情況及運(yùn)動(dòng)能力的異常,這為其他傷害感受性行為的可靠性提供了保證。

Von Frey纖維絲實(shí)驗(yàn)和HPT均用于構(gòu)建動(dòng)物的急性疼痛模型,前者為急性機(jī)械刺激痛模型[18],后者為急性熱刺激痛模型[19]。這些測(cè)試通常采用逃避行為/回縮反射或者發(fā)聲作為疼痛指標(biāo)。在這些模型中,動(dòng)物的行為反應(yīng)導(dǎo)致傷害刺激的終止。在本實(shí)驗(yàn)中,給予幼年小鼠含氟飲水一段時(shí)間后,實(shí)驗(yàn)組小鼠的急性機(jī)械痛閾逐漸低于對(duì)照組小鼠。在HPT中,兩組小鼠均出現(xiàn)溫度依賴的潛伏期縮短,在溫度為46 ℃時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠疼痛反應(yīng)潛伏期呈現(xiàn)出低于對(duì)照組小鼠的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在溫度為50 ℃時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠疼痛反應(yīng)潛伏期顯著低于對(duì)照組小鼠;溫度為54 ℃時(shí)三組之間的疼痛潛伏期差異消失。該現(xiàn)象可能是由于溫度過高時(shí)(54 ℃)熱刺激過于強(qiáng)烈,各組小鼠均表現(xiàn)為快速的跳躍或舔咬后爪作為逃避反應(yīng),從而消除了組間差異。

FT是目前國內(nèi)外進(jìn)行炎性痛研究中經(jīng)典的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。它是通過向動(dòng)物后爪皮下注射少量傷害性化學(xué)刺激物(甲醛溶液),記錄動(dòng)物在化學(xué)刺激物作用下對(duì)被傷害腳爪的舔咬(licking and biting)以及收縮(flinching)行為[20]。該過程一般分三個(gè)階段,第一階段(早時(shí)相)為急性傷害性反應(yīng),從注射后立即開始,持續(xù)約5-10 min,是由于甲醛主要引起了C類纖維的興奮,直接刺激了傷害性感受器所致,是短暫的急性痛反應(yīng);中間階段為靜息期;第三階段(晚時(shí)相)從注射后20 min開始持續(xù)到注射后60 min,這個(gè)階段可觀察到動(dòng)物由于組織的炎性反應(yīng)產(chǎn)生的痛覺應(yīng)答。在本實(shí)驗(yàn)中,高濃度氟化物飲水小鼠在FT的兩個(gè)疼痛時(shí)相中的反應(yīng)均較對(duì)照組小鼠顯著,表現(xiàn)為甩爪次數(shù)的增多和舔咬爪時(shí)間的增長。

關(guān)于氟化物引起疼痛的原因,目前研究較少。Schnitzler等[21]認(rèn)為這種疼痛癥狀是骨源性的。他們對(duì)5位骨質(zhì)疏松的患者使用每日1.09 mg/kg氟化物治療,患者均出現(xiàn)疼痛癥狀,通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其存在骨小梁應(yīng)力性微結(jié)構(gòu)骨折[21]。但是Desmond等[22]對(duì)11位骨質(zhì)疏松患者給與平均78 mg/d氟化鈉治療后出現(xiàn)相似的疼痛癥狀,對(duì)其進(jìn)行連續(xù)的X線觀察,僅有5位患者存在應(yīng)力性微骨折,其余的患者并未表現(xiàn)出明顯的骨性損傷,Desmond等[22]由此認(rèn)為應(yīng)力性微骨折并不是造成疼痛唯一的原因,而是整個(gè)疼痛過程的一個(gè)組成部分。此外,還有學(xué)者推測(cè)過量的氟化物可能抑制胰島素的生成而導(dǎo)致高血糖,從而導(dǎo)致大鼠的疼痛癥狀[23]。因此,本實(shí)驗(yàn)觀察到的含氟飲水引起的小鼠基礎(chǔ)痛閾下降的外周和中樞機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

本研究通過給予小鼠高濃度氟化物飲水,在生長過程中及成年后通過疼痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)飲用水中含高濃度氟化鈉(100 mg/L)的小鼠基礎(chǔ)痛閾顯著降低,對(duì)包括急性機(jī)械刺激痛、急性熱刺激痛以及慢性炎性疼痛的反應(yīng)更為明顯。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探究慢性氟中毒患者疼痛癥狀出現(xiàn)的原因和機(jī)制提供了動(dòng)物模型。