李瑞林,孟 峻,劉 儒

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,呼和浩特 010050;*通訊作者,E-mail:nmfrank@163.com)

小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂是一特殊的阻滯過程,因卵母細(xì)胞發(fā)育需要,減數(shù)分裂會停滯在生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV),即G2期末。由生發(fā)泡期到生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD)是卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)的過程,相當(dāng)于有絲分裂G2/M期的過渡[1,2]。關(guān)于小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂G2期阻滯的機(jī)制研究已成為當(dāng)前國內(nèi)外的研究重點(diǎn)。目前一些研究者認(rèn)為蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/14-3-3ε/細(xì)胞分裂周期蛋白25B(cell division cycle 25B,Cdc25B)/成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor,MPF)通路在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程及G2期阻滯中具有調(diào)節(jié)作用,但關(guān)于Cdc25B蛋白和14-3-3ε蛋白是否存在相互作用及其作用位點(diǎn)尚不清楚。而免疫共沉淀利用抗原抗體結(jié)合的高特異性,已成為研究蛋白與蛋白相互作用的經(jīng)典方法[3],本研究采用免疫共沉淀法研究Cdc25B蛋白和14-3-3ε蛋白的相互作用及其具體的作用位點(diǎn),為小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂G2期阻滯的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及組織

HEK293細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。小鼠肝組織經(jīng)昆明雄性6-8周小鼠解剖后獲得,由內(nèi)蒙古大學(xué)提供。

1.2 主要試劑

克隆載體pGEM-T vector(Promega公司,美國),表達(dá)載體pcDNA3.1-ZEO(Invitrogen公司,美國),pEGFP C3載體由復(fù)旦大學(xué)劉喻博士惠贈,pBSK-CDC25B-WT、pBSK-CDC25B-S321A、pBSK-CDC25B-S321D由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)微免研究室保存,DH5α感受態(tài)菌株(上海澤生生物技術(shù)有限公司),質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Promega,美國),DNA快速純化/回收試劑盒(上海澤生生物技術(shù)有限公司),牛血清白蛋白(BSA,Fraction V,鹽城賽寶生物科技有限公司),fuGENG6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Molecular Biochemicals,德國),免疫共沉淀試劑盒(上海生工生物有限公司)。

1.3 主要儀器

基因擴(kuò)增儀(Biometra,德國),凝膠自動成像儀(GDS8000BIO-RAD,美國),紫外分光光度儀(PⅥ UNIcAM SPECTRONIC,英國),CO2培養(yǎng)箱CBll5(WTB-binder,德國)。

1.4 pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε表達(dá)載體的構(gòu)建

用Trizol提取小鼠肝組織(30 mg)RNA,設(shè)計(jì)14-3-3epsilon引物(NM-009536.4):5′-GACCGTGCCTGCAGGTTGC-3′和5′-CTTGCCAGTGTGGCCGGAGA-3′,預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度545 bp,RT-PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化,將回收純化的HA-14-3-3ε克隆到pGEM-T載體上,將正確的HA-14-3-3ε陽性克隆與pcDNA3.1-ZEO(+)載體用EcoR Ⅰ酶切后連接,構(gòu)建成pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε表達(dá)載體,經(jīng)凝膠電泳鑒定此重組載體是否插入正確。

1.5 pEGFP-Cdc25B表達(dá)載體的構(gòu)建

將pBSK-CDC25B-WT、pBSK-CDC25B-S321D、pBSK-CDC25B-S321A三種重組質(zhì)粒和載體pEGFP-C3分別用BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切,反應(yīng)體系在37 ℃水浴環(huán)境中反應(yīng)3 h。酶切反應(yīng)后,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物,回收CDC25B-WT、CDC25B-S321D、CDC25B-S321A、pEGFP-C3的cDNA片段,通過OD260 nm判斷其回收產(chǎn)量,用于載體重組。將回收片段進(jìn)行連接反應(yīng),取2 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109,按常規(guī)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行,涂板過夜。挑取單菌落在含Kana(+)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h,后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,取2 μl質(zhì)粒用XhoⅠ和BamH雙酶切鑒定。選擇酶切片段為1 800 bp的陽性克隆保存,并行序列測定,構(gòu)建成pEGFP-Cdc25B-WT,pEGFP-Cdc25B-Ser321A,pEGFP-Cdc25B-Ser321D表達(dá)載體。

1.6 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含100 U/ml青霉素,10% FBS,10 μg/ml鏈霉素),于37 ℃、5%CO2、98%飽和濕度培養(yǎng)箱。用fuGENG6轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照fuGENG6轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染組分為四組,分別為5μg pEGFP-Cdc25B-WT和5 μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε(Cdc25B-WT+14-3-3ε組);5 μg pEGFP-Cdc25B-Ser321A和5 μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε(Cdc25B-Ser321A+14-3-3ε組);5 μg pEGFP-Cdc25B-Ser321D和5 μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε(Cdc25B-Ser321D+14-3-3ε組);5 μg pEGFP-Cdc25B-Vector和5 μg pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε(Cdc25B-vector+14-3-3ε組)。

1.7 免疫共沉淀法測定14-3-3ε蛋白與Cdc25B S321位點(diǎn)的結(jié)合

加Protein G-瓊脂糖到含過濾片的柱子中,PBS洗滌瓊脂糖,低速離心洗四次。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,4 ℃ 800 r/min離心3 min,收集細(xì)胞。吸棄上清并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,完全去除PBS并保留細(xì)胞沉淀,用玻璃勻漿器勻漿30-50次,間隔1 min,重復(fù)3次。然后12 000 r/min離心5 min,收集上清液作為細(xì)胞裂解液。在新的微量離心管中加入細(xì)胞裂解物,PMSF和鼠單克隆抗HA抗體,4 ℃孵育1 h至過夜,將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到裝有洗滌過Protein G-瓊脂糖柱中,孵育2 h至過夜。將每個柱子中插入轉(zhuǎn)移到2 ml的新微量離心管中。離心去掉上清,用IP緩沖液洗滌沉淀瓊脂糖珠子5-6次,加入上樣緩沖液,輕輕混合珠子,密封柱子。在95 ℃加熱5 min,用薄紙或?yàn)V紙吸干蓋子周圍的水。將柱子插入到新的微量離心管中,以12 000g離心30 s,獲得免疫沉淀物。

用Western blotting分別檢測細(xì)胞裂解液和免疫沉淀物中Cdc25B和14-3-3ε蛋白的表達(dá),經(jīng)細(xì)胞裂解、提取蛋白、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育,通過化學(xué)發(fā)光及成像獲得免疫印跡結(jié)果圖,如免疫沉淀物中抗HA抗體和抗GFP抗體均存在(2條帶均顯影,判定為二者結(jié)合),表明Cdc25B和14-3-3ε相互結(jié)合,此實(shí)驗(yàn)中使用鼠單克隆抗HA抗體1 ∶800用于檢測外源性表達(dá)的14-3-3ε蛋白,抗-GFP抗體1 ∶8 000用于檢測外源性表達(dá)的Cdc25B蛋白。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε

使pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3εcDNA片段亞克隆至pmax-FP-Red-C表達(dá)載體中,用EcoR Ⅰ酶切重組質(zhì)粒,經(jīng)凝膠電泳鑒定可見4 800 bp的載體帶及800 bp的目的帶(見圖1),說明亞克隆成功。

Marker.DL2000 DNA;1.pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε;2.pmax-FP-Red-C圖1 重組質(zhì)粒EcoR Ⅰ單酶切鑒定結(jié)果Figure 1 Identification of pmax-FP-Red-HA-14-3-3ε plasmid after digested by EcoR Ⅰ

2.2 三種重組質(zhì)粒的測序及鑒定

雙酶切pEGFP-Cdc25B-Ser321A、pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Ser321D三種重組表達(dá)載體,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見約5 000 bp的載體條帶及1 800 bp的目的條帶(見圖2),與預(yù)期結(jié)果一致,經(jīng)上海澤生測序證明重組體構(gòu)建成功。

2.3 14-3-3ε和Cdc25B的免疫共沉淀結(jié)果

在各組細(xì)胞裂解中,除了Cdc25B-Vector組外,Cdc25B和14-3-3ε蛋白均有表達(dá)(見圖3);而在免疫沉淀物中,Cdc25B-WT和Cdc25B-S321D均與14-3-3ε蛋白有共沉淀(見圖3),表明兩者結(jié)合;而Cdc25BS321A與14-3-3ε無共沉淀(見圖3),表明兩者未結(jié)合。

Marker.DL15000 DNA;1.pEGFP-Cdc25B-WT;2.pEGFP-Cdc25B-Ser321A;3.pEGFP-Cdc25B-Ser321D圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Figure 2 Double enzyme digestion of recombinant pEGFP-Cdc25B plasmids

圖3 免疫共沉淀測定14-3-3ε和Cdc25B的相互作用Figure 3 Determination of the interaction of 14-3-3ε and Cdc25B by co-immunoprecipitation

3 討論

Cdc25B是一種絲氨酸/蘇氨酸雙特異性磷酸化酶,是細(xì)胞分裂的啟動者,在細(xì)胞周期中具有重要的調(diào)控作用[4,5]。而14-3-3ε是一高度保守的酸性蛋白,廣泛表達(dá)于真核生物體內(nèi),以穿梭胞核與胞質(zhì)的方式調(diào)節(jié)與之結(jié)合的靶蛋白的功能[6,7]。目前諸多研究表明,此蛋白可調(diào)節(jié)Cdc25B蛋白的活性和亞細(xì)胞定位,兩蛋白的結(jié)合對細(xì)胞分裂進(jìn)程有重要的調(diào)控作用[8]。早期的研究顯示,卵母細(xì)胞G2/M期的轉(zhuǎn)換需要激活Cdc2/cyclinB復(fù)合物(MPF),Wee1B/Myt1激酶能磷酸化Cdc2的Thr14和Tyr15,使MPF失活,卵母細(xì)胞停滯于G2期。而Cdc25B能使Cdc2的Thr14和Tyr15位點(diǎn)去磷酸化,激活MPF,啟動減數(shù)分裂的恢復(fù)[9,10]。Yang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)在爪蟾卵母細(xì)胞中,PKA磷酸化Cdc25B的287位絲氨酸(S287),14-3-3ε與磷酸化的Cdc25B S287的結(jié)合使得Cdc25B隔離于細(xì)胞質(zhì)不能進(jìn)入細(xì)胞核,不能激活核內(nèi)的MPF,從而使卵母細(xì)胞不能繼續(xù)分裂,停滯于第一次減數(shù)分裂的G2期。

Astuti等[12]研究表明,PKA可磷酸化Cdc25B的321位絲氨酸,引起GV期阻滯,而突變體S321A能完全解除PKA引起的GV期阻滯,而突變體S149不能解除GV期阻滯,因此Cdc25B的321位絲氨酸在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中有重要作用。Cui等[13]的研究表明,14-3-3ε通過與Cdc25B結(jié)合的方式阻滯小鼠受精卵G2/M期的轉(zhuǎn)換。Uchida等[14]研究表明:在HEK293細(xì)胞中,14-3-3ε通過與Cdc25B的309位絲氨酸結(jié)合的方式控制Cdc25B的細(xì)胞內(nèi)定位。那么小鼠卵母細(xì)胞是否也存在14-3-3ε,且與Cdc25B在減數(shù)分裂恢復(fù)過程中是否有相互作用。

本課題組之前對鼠卵母細(xì)胞的研究證明了14-3-3ε的存在,且在GV和GVBD期14-3-3ε蛋白的表達(dá)量沒有變化[15]。14-3-3ε siRNA使GV到GVBD的發(fā)生率為36%,而非小干擾RNA的GV到GVBD的發(fā)生率為0,說明14-3-3ε siRNA可促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的G2/M轉(zhuǎn)換[16]。為證明14-3-3ε和Cdc25B在調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中是否存在聯(lián)系,本課題組之前的研究實(shí)驗(yàn)初次證明小鼠卵母細(xì)胞的GV期,Cdc25B蛋白和14-3-3ε蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì);在GVBD前,一部分Cdc25B從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核;而在GVBD后,Cdc25B和14-3-3ε均勻地分布于整個細(xì)胞[17]。此結(jié)果表明在GV期Cdc25B和14-3-3ε兩蛋白可能具有相互作用,可能是因Cdc25B蛋白和14-3-3ε蛋白的結(jié)合使有絲分裂的Cdc25B隔離于胞質(zhì)而不能入核,不能繼續(xù)進(jìn)行減數(shù)分裂,使卵母細(xì)胞發(fā)生GV期阻滯。

為了驗(yàn)證14-3-3ε與Cdc25B確實(shí)能結(jié)合或有相互作用,本課題組進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。此實(shí)驗(yàn)證明了14-3-3ε與Cdc25B確實(shí)能結(jié)合,野生型Cdc25B能和14-3-3ε結(jié)合;而當(dāng)Cdc25B的321位絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r,Cdc25B與14-3-3ε不再結(jié)合;當(dāng)Cdc25B的321位絲氨酸突變?yōu)樘於彼釙r,Cdc25B仍然能結(jié)合14-3-3ε,說明S321D具有模擬磷酸化的作用。提示14-3-3ε只能與磷酸化的S321結(jié)合,而不與未被磷酸化的S321A結(jié)合,Cdc25B的321位絲氨酸是14-3-3ε和Cdc25B結(jié)合的特異性位點(diǎn)。14-3-3ε和Cdc25B的321位磷酸化的絲氨酸結(jié)合,使Cdc25B隔離于胞漿,卵母細(xì)胞停滯于G2期,當(dāng)14-3-3ε和Cdc25B的結(jié)合取消時,Cdc25B又可入核,激活MPF,啟動減數(shù)分裂。

關(guān)于14-3-3ε和Cdc25B的結(jié)合取消的分子機(jī)制將是以后的研究方向。此次研究初次證明在鼠卵母細(xì)胞中,S321是14-3-3ε和Cdc25B結(jié)合的特異性位點(diǎn),PKA磷酸化Cdc25B的321位絲氨酸,磷酸化的321位絲氨酸與14-3-3ε結(jié)合引起G2期阻滯,S321是一重要的細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn)。我們可以通過使S321位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化來人為地調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。通過此位點(diǎn)對細(xì)胞周期調(diào)控的研究成果可應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè),提高動物的繁殖數(shù)量,滿足人類肉食的需求;也可應(yīng)用于腫瘤的治療,使腫瘤細(xì)胞停滯在G2期,抑制腫瘤的生長;還可用于人類體外輔助生殖技術(shù),縮短受精卵的體外培育時間,盡早植入人體子宮,減少外界因素對受精卵的影響。近年來,不孕不育的患者逐漸增多,人類生殖輔助技術(shù)水平雖有很大的進(jìn)展,然而,這些新技術(shù)的實(shí)施都需要有受精能力及發(fā)育潛力極好的卵母細(xì)胞。因此,深入研究卵母細(xì)胞成熟調(diào)控的機(jī)制至關(guān)重要。