楊星九，黃 昊，馬 竣，周光朋，蔡海利，葉志海，王建銘，韓曉亮*，高 苒

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021； 2.博爾誠(北京)科技有限公司，北京 102600)

衰老是指機(jī)體對環(huán)境的生理和心理適應(yīng)能力進(jìn)行性降低、逐漸趨向死亡的現(xiàn)象。病理學(xué)上，衰老是應(yīng)激和勞損，損傷和感染，免疫反應(yīng)衰退，營養(yǎng)失調(diào)，代謝障礙以及疏忽和濫用藥物積累的結(jié)果，是包括癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病的主要危險因素[1]。尋找可靠的衰老生物標(biāo)志物和延緩生理衰老的方法一直是科學(xué)家們熱衷研究的領(lǐng)域之一。

衰老是一個緩慢而復(fù)雜的生物進(jìn)程，涉及遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)等因素的作用和相互作用[2]。DNA甲基化修飾是一種表觀遺傳標(biāo)記，是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)或去甲基化酶的作用下，在基因組DNA中的CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合或去除一個甲基基團(tuán)。DNA甲基化修飾是能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)，進(jìn)而通過基因表達(dá)調(diào)控實(shí)現(xiàn)多種生物過程的發(fā)生和進(jìn)行，包括胚胎發(fā)育、基因組印記和衰老等[3]。多種常見疾病涉及DNA甲基化修飾異常，如癌癥、心血管疾病、衰老和代謝紊亂等[4]。

DNA甲基化是一種可以在人群中定量檢測的表觀遺傳標(biāo)記。近年的研究證明了人體基因組DNA甲基化的整體水平隨著年齡的增長顯著下降，并且很多研究報道了特定甲基化修飾位點(diǎn)與實(shí)際年齡具有顯著相關(guān)性[5]。Horvath和Hannum等[6-7]通過整合353和71個CpG位點(diǎn)建立了基于DNA甲基化的“表觀遺傳時鐘”模型；這些CpG位點(diǎn)的基因與細(xì)胞存活和發(fā)育顯著相關(guān)，通過檢測這些位點(diǎn)的DNA甲基化水平，可以評估機(jī)體的衰老進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)在患有與衰老相關(guān)疾病的人群中，如阿爾茨海默病、癌癥、心血管疾病和亨廷頓病，DNA甲基化年齡超過了實(shí)際年齡，此現(xiàn)象被定義為“年齡加速(age acceleration)”[5]。

越來越多的證據(jù)支持營養(yǎng)和飲食可以調(diào)控DNA甲基化修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)健康狀況和影響衰老進(jìn)程。Hannum等[8]運(yùn)用71個CpG位點(diǎn)的DNA甲基化水平建立了年齡預(yù)測模型，并通過觀察性研究發(fā)現(xiàn)增加魚類和蔬菜的攝入與表觀遺傳老化程度減弱具有相關(guān)性。Lee等[9]在近期也證明了外源補(bǔ)充葉酸、維生素B12和黃烷醇能夠延緩女性甲基化年齡的衰老。因此，通過飲食干預(yù)逆轉(zhuǎn)DNA甲基化修飾異常，從而延緩衰老進(jìn)程將可能成為一個新興的研究領(lǐng)域。

我們通過數(shù)據(jù)庫(Pubmed， CNKI和萬方數(shù)據(jù)庫)檢索關(guān)于DNA甲基化標(biāo)志物和年齡預(yù)測的文獻(xiàn)，根據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)中特定基因的DNA甲基化率與年齡的相關(guān)性，確定了兩個與人體衰老進(jìn)程相關(guān)的甲基化基因，分別是促泌素(secretagogin，SCGN)和整合素亞基α2b(integrin subunit alpha 2b，ITGA2B)基因。本研究進(jìn)一步運(yùn)用GEO數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證了SCGN和ITGA2B基因甲基化標(biāo)志物與人體衰老進(jìn)程的相關(guān)性，并基于全基因組甲基化芯片數(shù)據(jù)，篩選其中與衰老進(jìn)程相關(guān)性最高的甲基化位點(diǎn)，從而建立了相應(yīng)的甲基化qPCR檢測體系。最后，我們通過獨(dú)立樣本的檢測進(jìn)一步驗(yàn)證其與衰老的相關(guān)性，并評估了抗衰老天然提取物中的有效物質(zhì)對與衰老相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)志物甲基化水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 外周血樣本

53名健康志愿者參與了此項(xiàng)研究；其中男性30例，平均41歲(24～60歲)，女性23例，平均41.4歲(27～60歲)，相應(yīng)性別和年齡分布見表1，年齡和性別分布無顯著差異(P=0.756)。本研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)遵循福利倫理的相關(guān)規(guī)則和要求，符合涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究的倫理原則，包括知情同意原則、控制風(fēng)險原則、免費(fèi)和補(bǔ)償原則、保護(hù)隱私原則、依法賠償原則和特殊保護(hù)原則，所有志愿者同意此項(xiàng)研究并簽署了知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞

胃癌AGS細(xì)胞系和肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.3 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫

PubMed數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)，中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(www.cnki.net/)和萬方數(shù)據(jù)庫(www.wanfangdata.com.cn)；全基因組甲基化譜數(shù)據(jù)來源：基因表達(dá)匯編(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

1.2 主要試劑與儀器

血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒和亞硫酸氫鹽處理試劑盒購自博爾誠(北京)科技有限公司；細(xì)胞RMPI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；阿扎胞苷(5-azacytidine, 5-Aza)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和沒食子酸(gallic acid， GA)購自美國Sigma公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；PCR引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。磁珠分離架購自美國Invitrogen公司，實(shí)時定量PCR儀ABI 7500購自Life Technologies公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 篩選和驗(yàn)證與衰老進(jìn)程相關(guān)的甲基化基因

通過數(shù)據(jù)庫(Pubmed，中國知網(wǎng)和萬方)檢索關(guān)于DNA甲基化標(biāo)志物和衰老相關(guān)的文獻(xiàn)，關(guān)鍵詞“methylation”，“biomarker”，“aging”和“甲基化”，“標(biāo)志物”，“衰老”或“年齡”，根據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)中特定基因的DNA甲基化率與年齡的相關(guān)性，篩選出了一組候選的與衰老相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)志物。通過檢索公共數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO)，獲取涉及人體衰老進(jìn)程的全基因組甲基化調(diào)控的數(shù)據(jù)，并利用這些數(shù)據(jù)通過與年齡的相關(guān)性分析對上述甲基化基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2 建立和驗(yàn)證與衰老進(jìn)程相關(guān)的甲基化基因的qPCR檢測方法

細(xì)胞基因組DNA提取、定量及亞硫酸氫鹽處理：血液和培養(yǎng)的細(xì)胞均按照血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(博爾誠(北京)科技有限公司)說明書步驟，提取細(xì)胞基因組DNA，使用核酸蛋白濃度分析儀測定所提取DNA的濃度和純度。使用亞硫酸氫鹽處理試劑盒(博爾誠(北京)科技有限公司)說明書對符合要求的血細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理、純化；-20℃保存，48 h內(nèi)使用。

1.3.3 DNA甲基化位點(diǎn)的選定及其對應(yīng)引物、探針的合成

基于全基因組甲基化芯片數(shù)據(jù)，挑選了與人體衰老進(jìn)程相關(guān)性最高的SCGN和ITGA2B基因及位點(diǎn)，采用Meth-Primer軟件對基因序列進(jìn)行分析，設(shè)計相應(yīng)基因序列的引物序列及探針，建立了其甲基化qPCR檢測體系。引物和探針序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。

表1 健康志愿者性別、年齡分布資料

表2 引物、探針序列

1.3.4 DNA甲基化陰陽性對照實(shí)驗(yàn)及實(shí)時定量PCR及其結(jié)果判定

使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理的白細(xì)胞基因組DNA作為目標(biāo)基因靶序列甲基化狀態(tài)的陽性參考品，全基因組擴(kuò)增的白細(xì)胞基因組DNA作為目標(biāo)基因靶序列甲基化水平的陰性參考品，ACTB(β-Actin)作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時定量PCR，摸索基因的引物、探針等最佳反應(yīng)條件。本研究使用ABI 7500實(shí)時定量PCR儀對DNA樣本進(jìn)行PCR反應(yīng)，50 μL體系中添加PCR反應(yīng)液30 μL和DNA樣本液20 μL，反應(yīng)液中包含正、反向引物(0.3 μmol/L)，檢測探針(1 μmol/L)。以2-ΔΔCT計算基因特異位點(diǎn)甲基化在細(xì)胞系中相對水平，其中ΔCT(試驗(yàn)樣品)=CT(試驗(yàn)樣品，目的基因)—CT(試驗(yàn)樣品，內(nèi)參基因ACTB)，ΔΔCT(試驗(yàn)樣品)=ΔCT(試驗(yàn)樣品)—ΔCT(陽性參考品)。

注：A：SCGN甲基化水平與年齡呈正相關(guān)；B：ITGA2B甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)。圖1 SCGN和ITGA2B基因甲基化水平與年齡的相關(guān)性Note. A, Methylation level of SCGN was positively correlated with age. B, Methylation level of ITGA2B was negatively correlated with age.Figure 1 Correlation between SCGN and ITGA2B methylation levels and age

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌AGS細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)液內(nèi)(含10%胎牛血清)，每48 h更換培養(yǎng)基，使用0.04%胰酶消化液消化細(xì)胞傳代，對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)

對數(shù)生長期細(xì)胞1×104個接種于96孔板，3種藥物按照不同濃度稀釋加入培養(yǎng)孔，每種藥物設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后吸棄上清，更換完全培養(yǎng)液(含10% CCK8)，繼續(xù)37℃孵箱培養(yǎng)3 h，振蕩床輕微振蕩10 s，采用自動酶標(biāo)儀(Bio-Rad)檢測各孔450 nm波長的吸光度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 甲基化基因特異位點(diǎn)的篩選及驗(yàn)證

通過256例人體外周血白細(xì)胞基因組DNA的全基因組甲基化芯片(Illumina公司的Human Methylation 450k芯片)數(shù)據(jù)與相應(yīng)個體年齡的相關(guān)性分析，驗(yàn)證了候選DNA甲基化標(biāo)志物促泌素(secretagogin，SCGN)和去甲基化標(biāo)志物整合素亞基α2b(integrin subunit alpha 2b，ITGA2B)的甲基化率(β)與生物年齡均具有顯著性相關(guān)性(圖1)，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.6439和0.7233，P值均小于0.001。

2.2 甲基化陰陽性對照體系的選擇

在本研究中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理的白細(xì)胞基因組DNA的目標(biāo)基因靶序列為完全甲基化狀態(tài)，全基因組擴(kuò)增的白細(xì)胞基因組DNA的目標(biāo)基因靶序列為完全去甲基化狀態(tài)。因此，我們使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理的白細(xì)胞基因組DNA作為目標(biāo)基因靶序列甲基化狀態(tài)的陽性參考品，全基因組擴(kuò)增的白細(xì)胞基因組DNA作為目標(biāo)基因靶序列甲基化水平的陰性參考品。

經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)摸索條件后確定最優(yōu)反應(yīng)條件：94℃ 20 min；55.5℃ 35 s，93℃ 30 s，45個循環(huán)；40℃ 5 s；4℃保存。對陽性參考品的檢測中，SCGN基因靶序列顯示發(fā)生擴(kuò)增，在45個循環(huán)內(nèi)未檢測到ITGA2B基因靶序列的擴(kuò)增(圖2A)，對陰性參考品的檢測中，ITGA2B基因靶序列顯示發(fā)生擴(kuò)增，而在45個循環(huán)內(nèi)未檢測到SCGN基因靶序列的擴(kuò)增(圖2B)，說明本系統(tǒng)均能夠特異檢測到處于甲基化狀態(tài)的SCGN和去甲基化狀態(tài)ITGA2B基因。

注：A：陽性參考品能特異檢測到甲基化的SCGN；B：陰性參考品能特異檢測到去甲基化的ITGA2B。圖2 SCGN和ITGA2B檢測體系的擴(kuò)增曲線Note. A, Positive reference can specifically detect methylated SCGN. B, Negative reference can specifically detect demethylated ITGA2B.Figure 2 Amplification curves of the SCGN and ITGA2B detection systems

2.3 SCGN的甲基化和ITGA2B的去甲基化水平均與年齡呈線性關(guān)系

2.4 EGCG和GA抑制腫瘤細(xì)胞存活

腫瘤是衰老的一種表現(xiàn)，綠茶提取物的主要成分EGCG和GA已證明具有延緩衰老的功效，本研究使用EGCG和GA作用于胃癌細(xì)胞AGS和肝癌細(xì)胞HepG2，觀察EGCG和GA對腫瘤細(xì)胞存活能力的影響，化療藥物5-Aza作為陽性對照。結(jié)果顯示5-Aza，EGCG和GA對胃癌細(xì)胞AGS和肝癌細(xì)胞HepG2均具有顯著的抑制生存作用(劑量-存活曲線，見圖4)，IC50分別為21.4 μmol/L、26.1 μmol/L、40 μmol/L和13.9 μmol/L、62.1 μmol/L、114.4 μmol/L。

2.5 EGCG和GA逆轉(zhuǎn)細(xì)胞中的SCGN的甲基化和ITGA2B的去甲基化水平

注：A：SCGN甲基化水平與年齡呈正相關(guān)；B：ITGA2B甲基化水平與年齡呈負(fù)相關(guān)；C：基于SCGN和ITGA2B甲基化水平的模型相對值與年齡呈正相關(guān)；D：男性和女性的基于SCGN和ITGA2B甲基化水平的模型相對值與年齡均呈正相關(guān)。圖3 SCGN和ITGA2B基因甲基化水平與年齡的相關(guān)性Note. A, Methylation level of SCGN was positively correlated with age. B, Methylation level of ITGA2B was negatively correlated with age. C, Relative values of the model based on SCGN and ITGA2B methylation levels were positively correlated with age. D, Both relative values of the model based on SCGN and ITGA2B methylation levels of males and females were positively correlated with age.Figure 3 Correlation between SCGN and ITGA2B gene methylation level and age

注：A、B和C：分別顯示5-Aza、EGCG和GA對胃癌AGS和肝癌HepG2細(xì)胞48 h的劑量—存活曲線。圖4 藥物對AGS和HepG2細(xì)胞的劑量—存活曲線Note. Dose-survival curves of 5-Aza (A), EGCG (B), and GA (C) for gastric cancer AGS cells and liver cancer HepG2 cells for 48 h, respectively.Figure 4 Dose-survival curves of drugs on AGS and HepG2 cells

阿扎胞苷(5-Aza)是一種胞嘧啶核苷類藥物，能直接摻入DNA中，抑制DNA和RNA合成，可殺傷處于S期的細(xì)胞，其可以抑制基因組DNA的整體甲基化，無特異靶向性，本研究中使用5-Aza作為逆轉(zhuǎn)DNA甲基化的陽性對照藥物。綠茶提取物的主要成分EGCG和GA已證明具有延緩衰老的功效，我們使用EGCG和GA處理胃癌細(xì)胞AGS和肝癌細(xì)胞HepG2后，發(fā)現(xiàn)基因組DNA中SCGN基因的甲基化水平下降，ITGA2B基因的去甲基化水平下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而已知的廣譜的DNA甲基化抑制劑5-Aza能夠顯著抑制SCGN的甲基化水平和增加ITGA2B的去甲基化水平(即ITGA2B的甲基化水平下降)(如圖5)。以上說明EGCG和GA可能通過多靶點(diǎn)抑制衰老作用基因的甲基化水平(SCGN)和去甲基化水平(ITGA2B)從而逆轉(zhuǎn)衰老進(jìn)程，而5-Aza通過抑制基因組DNA的整體甲基化水平，更多的發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。因此，本檢測方法能夠用于監(jiān)測藥物、營養(yǎng)品、或保健品對細(xì)胞、組織、或人體的抗衰老作用和功效評估。

注：A：5-Aza、EGCG和GA均能下調(diào)AGS和HepG2細(xì)胞的SCGN甲基化水平；B：5-Aza上調(diào)AGS和HepG2細(xì)胞的ITGA2B的去甲基化水平(即下調(diào)甲基化)，EGCG和GA顯著下調(diào)ITGA2B的去甲基化。*P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001。 圖5 藥物對細(xì)胞系SCGN、ITGA2B基因甲基化水平的影響Note. A, 5-Aza, EGCG, and GA down-regulated SCGN methylation levels in AGS and HepG2 cells. B, 5-Aza up-regulated the demethylation level of ITGA2B in AGS and HepG2 cells (i.e., down-regulation of methylation), and EGCG and GA significantly down-regulated the demethylation of ITGA2B. *P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001.Figure 5 Effect of drugs on the methylation levels of SCGN and ITGA2B genes in cell lines

3 討論

迄今為止，DNA甲基化是在衰老研究中最為廣泛研究的表觀遺傳機(jī)制。近年全基因組DNA甲基化測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，DNA甲基化在衰老研究領(lǐng)域中的研究成果快速增長。隨著機(jī)體組織的衰老，基因組DNA甲基化整體水平通常會降低，但某些與特定基因相關(guān)的DNA序列在衰老過程中發(fā)生DNA甲基化水平上升[10]。隨著這些研究成果的積累，表觀年齡的概念被逐步建立和接受。在已建立的多種“表觀遺傳時鐘”模型中，Horvath等建立的基于353個CpG位點(diǎn)的DNA甲基化預(yù)測模型被廣泛使用，其年齡預(yù)測準(zhǔn)確度為+/-3.6年[6]。Hannum等利用血細(xì)胞基因組DNA甲基化數(shù)據(jù)建立的基于71個CpG位點(diǎn)的年齡預(yù)測模型與年齡具有較高的相關(guān)性，預(yù)測準(zhǔn)確度為+/-4.9年[7]。即使Horvath和Hannum的“表觀遺傳時鐘”模型顯示與實(shí)際年齡較高的相關(guān)性，但兩個模型只共享了5個CpG位點(diǎn)[5]。Weidner等開發(fā)了一種基于血液樣本的“表觀遺傳時鐘”，其優(yōu)先將數(shù)據(jù)集減少到與年齡高度相關(guān)的102個CpG位點(diǎn)，其中ITGA2B，ASPA和PDE4C基因上的3個CpG位點(diǎn)構(gòu)建的預(yù)測模型顯示與實(shí)際年齡具有較高的相關(guān)性，預(yù)測準(zhǔn)確度為+/-3.3年[11]。以上位點(diǎn)的數(shù)據(jù)均是基于微陣列芯片研究，需要大量的DNA和復(fù)雜的生物信息學(xué)分析。因此，我們擬篩選一組與年齡相關(guān)的甲基化基因，并通過設(shè)計特異引物和探針識別和量化與單個表觀遺傳位點(diǎn)相關(guān)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，從而簡化操作流程和降低檢測成本。

通過文獻(xiàn)檢索分析，我們確定了一組與人體衰老進(jìn)程相關(guān)的甲基化基因，運(yùn)用GEO數(shù)據(jù)庫對這些甲基化相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCGN和ITGA2B基因甲基化水平與年齡具有顯著相關(guān)性。根據(jù)微陣列芯片中基因甲基化與年齡的相關(guān)性及探針位點(diǎn)(SCGN：cg06493994，ITGA2B：cg25809905)，我們對SCGN和ITGA2B的特異位點(diǎn)的DNA甲基化檢測建立了定量PCR檢測體系。SCGN基因位于6號染色體上，編碼的蛋白是一種分泌型鈣結(jié)合蛋白，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，該蛋白被認(rèn)為參與氯化鉀刺激的鈣通量和細(xì)胞增殖[12-13]。ITGA2B基因位于17號染色體上，編碼的蛋白是整合素鏈家族成員之一，編碼前原蛋白經(jīng)蛋白水解生成輕鏈和重鏈，通過二硫鍵結(jié)合形成α-2b/β-3整合素細(xì)胞粘附受體的亞基，這種受體通過介導(dǎo)血小板聚集在血液凝固系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[14]。

在本研究中，我們使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶處理的白細(xì)胞基因組DNA和全基因組擴(kuò)增的白細(xì)胞基因組DNA分別作為目標(biāo)基因靶序列甲基化狀態(tài)的陽性參考品和陰性參考品，建立了SCGN和ITGA2B的特異位點(diǎn)的DNA甲基化檢測體系。對53名志愿者血漿檢測結(jié)果顯示SCGN和ITGA2B基因靶序列的甲基化水平均與年齡呈顯著的相關(guān)性，其與相關(guān)研究結(jié)果一致。進(jìn)一步對SCGN基因靶序列的Ct值和ITGA2B基因靶序列的Ct值進(jìn)行回歸分析，獲得回歸方程，結(jié)果顯示回歸方程計算的幾何平均值與年齡具有更顯著的相關(guān)性。Horvath和Hannum的DNA甲基化表觀年齡預(yù)測的檢測使用甲基化芯片檢測(Infinium 450K)，檢測費(fèi)用昂貴，技術(shù)難度大，難以廣泛推廣。我們在本研究中通過檢測SCGN的甲基化和ITGA2B的去甲基化水平，建立了一種新的DNA甲基化衰老預(yù)測模型，該模型推算的結(jié)果與生物年齡具有較好的相關(guān)性。

營養(yǎng)素和飲食，如葉酸、膽堿、蛋氨酸、維生素B6和B12，可以通過參與單碳代謝，促進(jìn)S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)(通用甲基供體)產(chǎn)生，增強(qiáng)DNA甲基化，從而實(shí)現(xiàn)DNA甲基化修飾的調(diào)控[15-16]。天然提取物的主要成分，如表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)、沒食子酸(GA)、白藜蘆醇、類黃酮、木黃酮和槲黃素等，可以通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致整體DNA甲基化水平下降[16]。營養(yǎng)素和飲食可以通過DNA甲基化的調(diào)控調(diào)節(jié)代謝、改變疾病易感性，從而維持健康及預(yù)防疾病發(fā)生[17-19]。

腫瘤是細(xì)胞衰老的表現(xiàn)和結(jié)果。我們使用腫瘤細(xì)胞模型對化療藥物5-Aza和天然化合物EGCG、GA進(jìn)行了評估，觀察化合物對細(xì)胞生長增殖能力及對SCGN和ITGA2B的甲基化水平的影響。結(jié)果顯示5-Aza，EGCG和GA對胃癌細(xì)胞AGS和肝癌細(xì)胞HepG2均具有顯著的抑制生長增殖作用。EGCG和GA能夠逆轉(zhuǎn)基因組DNA中SCGN的甲基化和ITGA2B的去甲基化，而已知的DNMT1抑制劑5-Aza能夠顯著抑制基因組的DNA甲基化水平，包括SCGN和ITGA2B。說明EGCG和GA可能通過多種機(jī)制調(diào)控衰老相關(guān)基因的甲基化水平(SCGN)和去甲基化水平(ITGA2B)，從而逆轉(zhuǎn)衰老程度。天然化合物EGCG和GA是綠茶提取物和發(fā)酵烏龍茶提取物的主要成分，已證明具有逆轉(zhuǎn)DNA甲基化及延緩衰老的功效[20-22]，本研究的結(jié)果與其相一致。因此，通過檢測SCGN和ITGA2B的甲基化水平，可以評估機(jī)體的衰老程度，進(jìn)一步可以作為評估藥物、營養(yǎng)品或保健品對細(xì)胞、機(jī)體或人體的抗衰老作用和功效。

本研究建立的基于SCGN和ITGA2B的甲基化水平衰老預(yù)測模型，與實(shí)際年齡具有較好的相關(guān)性，但標(biāo)準(zhǔn)誤差仍然較大，可能與模型建立使用的樣本量太小(53例)相關(guān)。另一方面，表觀遺傳學(xué)的變化與機(jī)體的健康狀態(tài)相關(guān)，我們猜測模型構(gòu)建的樣本人群的健康狀態(tài)也是導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)誤差較大的主要原因之一，即模型預(yù)測值反映的是機(jī)體的健康狀態(tài)，根據(jù)模型預(yù)測值推算的生物學(xué)年齡高于正常值，說明機(jī)體可能處于亞健康狀態(tài)。因此，我們需要大規(guī)模收集樣本，并了解樣本人群的健康狀態(tài)，整體評估衰老預(yù)測模型，同時評估基于SCGN和ITGA2B的甲基化水平衰老預(yù)測模型用于評估機(jī)體健康狀態(tài)的可能性。

人體衰老是一個緩慢而復(fù)雜的生物進(jìn)程，涉及遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)等因素的作用和相互作用。基因組甲基化調(diào)控是表觀遺傳學(xué)的一種重要機(jī)制。此項(xiàng)研究驗(yàn)證了文獻(xiàn)報道的SCGN和ITGA2B基因甲基化調(diào)控與衰老進(jìn)程的相關(guān)性，并建立了一種方便、便捷的甲基化qPCR檢測方法及衰老預(yù)測模型。借助這一檢測方法，我們篩選、驗(yàn)證了抗衰老天然提取物中有效成分對SCGN和ITGA2B基因甲基化調(diào)控的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。此項(xiàng)研究證明了與人體衰老相關(guān)的甲基化調(diào)控有可能在藥物或營養(yǎng)物質(zhì)的作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)，并通過檢測特定基因甲基化調(diào)控的變化有可能用于監(jiān)測人體衰老進(jìn)程，另一方面，檢測特定基因甲基化調(diào)控的變化有可能用于檢測人體的健康狀態(tài)，這為基于基因甲基化調(diào)控機(jī)制開發(fā)抗衰老或者調(diào)節(jié)健康狀態(tài)的藥物或產(chǎn)品提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)和研發(fā)工具。