馮丹丹，陳 沫，杜小燕，陳振文*

(1.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，北京 100069； 2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京 100050)

長爪沙鼠是源自我國的實驗動物資源，因其獨特的解剖結(jié)構(gòu)以及對微生物易感性等原因，已廣泛地應用于腦神經(jīng)、微生物、營養(yǎng)、代謝及腫瘤等諸多領(lǐng)域研究，被譽為“多功能”實驗動物。但有關(guān)長爪沙鼠的遺傳學研究相對較少，尤其是遺傳標記物的開發(fā)和應用遠滯后于對其生物學特性和實驗應用研究。目前國內(nèi)外僅有Neumann等[1]通過用克隆方法找到的9個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點并對野生長爪沙鼠和人工飼養(yǎng)群體進行了多態(tài)性分析。趙太云，譚元卿等[2-3]利用種間擴增轉(zhuǎn)移法，在536對小鼠微衛(wèi)星引物中篩選出了長爪沙鼠微衛(wèi)星位點 130 個。依據(jù)這些微衛(wèi)星位點，浙江省和北京市分別用28個微衛(wèi)星位點建立了《長爪沙鼠遺傳質(zhì)量控制》地方標準[4-5]，中國實驗動物學會也據(jù)此發(fā)布了實驗動物行業(yè)標準[6]。這有效解決了長爪沙鼠遺傳質(zhì)量無據(jù)可依的狀態(tài)，也為長爪沙鼠從實驗用動物提升為實驗動物奠定了基礎(chǔ)。但在實際應用中發(fā)現(xiàn)標準中遺傳質(zhì)量檢測所用的微衛(wèi)星位點存在一定不足，表現(xiàn)為個別位點多態(tài)性不夠高、個別位點擴增效果不夠好、缺乏近交系遺傳檢測方法和位點等，因此有必要進一步尋找更多和更有效的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點。我們前期工作中對長爪沙鼠全基因組進行了測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠基因組中存在大量重復序列，但是這些微衛(wèi)星能否成功擴增和是否適于遺傳檢測尚不確定。本研究中我們根據(jù)微衛(wèi)星序列特征的標準選取了重復序列357個[7]，并根據(jù)這些序列的側(cè)翼序列設(shè)計并合成相應的引物進行PCR擴增，最終成功篩選出135個能有效擴增的微衛(wèi)星位點，通過近交系和封閉群長爪沙鼠基因組對位點進行測試，優(yōu)化出適用于長爪沙鼠近交系區(qū)分和封閉群遺傳分析的微衛(wèi)星位點。這些微衛(wèi)星位點的獲取進一步豐富了長爪沙鼠的遺傳信息，為建立長爪沙鼠遺傳數(shù)據(jù)庫積累了數(shù)據(jù)[8]，同時為制定長爪沙鼠近交系遺傳質(zhì)量標準和進一步完善和修改目前標準提供了依據(jù)，為下一步建立長爪沙鼠遺傳質(zhì)量國家標準奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取普通級長爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系F20代動物各6只[9-10]，性別、年齡、體重不限，自行培育；普通級封閉群長爪沙鼠12只，性別、年齡、體重不限，由首都醫(yī)科大學實驗動物部提供。本實驗通過首都醫(yī)科大學實驗動物和動物實驗倫理委員會批準(No.：AEEI-2017-032)，在實驗過程中按照實驗動物使用的3R原則給予動物人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：Taq聚合酶、dNTP、10× PCR buffer和50 bp DNA marker(大連寶生物工程有限公司)；低熔點瓊脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)。儀器：PCR儀(美國Bio-Rad公司)；PAC-30型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠圖像儀(美國Bio-Rad公司)；漩渦混合器(北京科爾德科貿(mào)有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 長爪沙鼠基因組DNA的提取

將0.1 g肝組織切成片并置于2 mL組織消化緩沖液中，然后加入20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，充分混勻后在55℃下消化12 h。然后用苯酚∶氯仿(比例=1∶1)萃取消化混合物，用乙醇沉淀DNA并溶解在TE緩沖液中。用Nanodrop 2000 C 微量分光光度計檢測所得DNA質(zhì)量，用TE溶液將已知濃度的DNA原液稀釋為50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆茫瑢NA原液保存于-80℃。

1.3.2 微衛(wèi)星位點的選擇與引物合成

選擇位于長爪沙鼠基因組序列中符合微衛(wèi)星標準的重復序列357個[4]，根據(jù)每個微衛(wèi)星位點的側(cè)翼特異序列應用Primer 5軟件進行引物的設(shè)計，每個位點2～4條引物，所有引物均由北京天一輝遠有限公司合成。通過PCR實驗對以上位點的PCR反應條件進行優(yōu)化，確定能成功擴增的引物、最佳退火溫度和Mg2+離子濃度。

1.3.3 PCR擴增

PCR反應體系的建立：總反應體系20 μL，其中：10× buffer 2 μL，上下游引物(100 μmol/μL)各0.1 μL，dNTP Mg2+plus(100 μmol/L)1.2 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，基因組DNA(50～100 ng/μL) 1 μL，雙蒸水(ddH2O)15.4 μL。

PCR擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，接72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

稱取瓊脂糖2 g，加入到100 mL 0.5× TBE中，用微波爐加熱約5～10 min，自然冷卻至50℃左右，加入EB混勻，使EB終濃度為0.5 μg/mL，灌入插好梳子的凝膠槽中，約30 min后拔出梳子。將凝膠放入電泳槽中。吸取5 μL樣品加1 μL 6× loading buffer混勻,加入凝膠孔中。在凝膠樣品中央或兩側(cè)加入3～5 μL的50 bp DNA marker。電泳條件為120 V，35 min，將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點的篩選

針對預選出的357個串聯(lián)重復序列，根據(jù)其側(cè)翼序列合成了357對微衛(wèi)星位點引物，經(jīng)PCR擴增，135個微衛(wèi)星位點獲得成功擴增的PCR產(chǎn)物(135/357，37.82%)，并篩選出引物的最適退火溫度，部分典型位點擴增見圖1。 135個微衛(wèi)星位點的名稱、引物序列、目的片段大小、核心序列類型和重復次數(shù)及PCR反應條件見表1。在篩選出的135個微衛(wèi)星位點中，二核苷酸和三核苷酸重復的位點分別為112和23個，微衛(wèi)星核苷酸重復次數(shù)范圍為3～28次，目的片段大小范圍為51 ～ 271 bp。

注：A：ccmu152位點；B：ccmu183位點。M：50 bp marker；圖示數(shù)字為PCR反應時所用退火溫度(℃)。圖1 典型的微衛(wèi)星位點退火溫度梯度優(yōu)化電泳結(jié)果(ccmu152和ccmu183兩個位點)Note. A, Locus ccmu152. B, Locus ccmu183. M, 50 bp marker. Numbers represent annealing temperatures (℃).Figure 1 Typical electrophoretic map of annealing temperature gradient optimization for loci ccmu152 and ccmu183

表1135個微衛(wèi)星位點的名稱、引物序列、目的片段大小、核苷酸類型和重復次數(shù)及PCR反應條件

Table1Sequencing and polymerase chain reaction (PCR) conditions of 135 microsatellite loci

位點Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu131TGGTAGATGCTGGTTTTGCTGATAGTACAGCCTCCCCATTGGAT250(TG)23601.5ccmu132GGCGCTTAACCTACTCAGTCCAAACCACAGATCACGTCAGTCC300(AG)28601.5ccmu133CCTGAGCTTGTCCGTGAATCCCTAGTAGGATGCTTTCCCTCTTGT219(AAT)16601.5ccmu134CGGTACAACTGGTACAAAGCGGAGCCGGGGCTTTACACTAT263(AAT)16601.5ccmu135CTCTGAGCTTCAAGGAGCCCAGCCAGTTCTCCACCTCTG119(AAT)16601.5ccmu136CACAGGTTAAAGTGTAGGGGCATAAAAGTTGGAGGCCGAGTG285(AG)28601.5ccmu137TGCTGCTTGTCTTCCACCTTCTGACCTCCACACTCATGCC139(TG)18601.5ccmu138GTCTGGGAGGATGGAGAGGTTGTCGTTCCCGTTGTTCTGT250(TG)18601.5ccmu139GGTGCCCTGGAGTGAGCATCCCGCAGCTGGCGAGTTATC281(TG)18601.5ccmu140TGCTCTGTATCGCTTTGGTTGAACTTAGCATACAAAGCCCAGCCT223(TG)18601.5ccmu141CAGAAAACTCAAGTTCTCAGGTTTATGGTCACCACCATCTCTATGC284(TG)18601.5ccmu142GCTTTTAGTTGTACAGGCTGTGGGCAGTGATAGACCTTGCTCCA207(TG)18601.5ccmu143GCAGACGCCAGTCGCTAAAAAAACACAAGTGTTCTTGAGGAGAAA230(AC)19601.5ccmu144ACTATCCCATGAAATAGAGTCTTGAGTTTCAGCATTCCACCACAG307(AC)19601.5ccmu145ACTTCAAGATTCTTCTGCCAGGTACCAGATGCCCCAGTCTGTA224(AC)19601.5ccmu146TTTTAGCGTGGCCATTCCTACCCACTGGGAGACAGTGAGATTC279(AGG)13601.5ccmu147CCTGGATAAGGGAGGCAATCTCTGAAAACCTGAGTGAGCGTC230(TAA)12601.5ccmu148GACTCATGCAACCAACAACACAGCACACCCTTTGATTCTGTTTC208(TAA)13601.5ccmu149TAGGGTCTGAGGTTAAGTGCCGGACAAAAAGACTAGAACTGGGTC218(AAT)16601.5ccmu150TGTGGACTGAGTGCGTGATCTCTTCGAGGATAGGCAGTTT291(CT)28601.5ccmu151CAAATAAACGGCAATGCCTCAAGAGTGATAATGCAGGTGCCC172(TG)18601.5

(續(xù)表1)

位點Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu152ACTGGGCATTGCAGGAACTTACAGTGGTCAGCCAAACACA231(TG)18601.5ccmu153GATGTCATGTATGTGTTACCAGTTTGGTCATTGCAGTGCCTTTCTAC222(TG)18601.5ccmu154AATATCCTGAGTCCTCTCACTCTCGCCCTGGACCATACACATATT214(AC)19601.5ccmu155AGCAGGCGAAAGCACTCCAAGAAGCCCATAGTGCTGGC269(AGG)13601.5ccmu156ATGGCTAATGCCCTGGTGGTCCTGTGGTAGTTGGGCAGTAA190(TAA)11601.5ccmu157TCCAAGGCGTCACCAAGTTCCCCGTCTTAGTTCTGTGGGT213(AT)18601.5ccmu158CTGTTCAGGCCTCCATGCTCGCTGAGACCATTTCTGCGATG197(AC)15601.5ccmu159TCCAGTTGTGTGGAAGGAAGTGTAGGCCTTGGTGTAGGACT208(CA)20601.5ccmu160TCTAACTGCTAAGGCCTGCTACACCCTAAGGAAGGGGAGC250(CAA)10601.5ccmu161ACGGTACACCTTGTCTAAGGCCGGAAATGGGGACTTAGGGG234(AC)13601.5ccmu162TCACCAGTGGAGTTTTGTCATCTGCCTTGAACACCGATAGAGA299(AC)13601.5ccmu163TACGATCTCAGTGATGTGCTGCACTGTTTGGCACAATGCTGG207(ATT)13601.5ccmu164AGTCTTTGGCCTTGTAGAGCTTTCAGGGAAGTGAAACATCAGCA136(AC)13601.5ccmu165ACTCTGGCTTCTGCCTTGACACTTCCCTTGCTTAGGTGGC258(AC)13601.5ccmu166CTGTTGGTAACATAGCAGGGCCCCCAACTTGACGATGACCA219(AC)13601.5ccmu167CCAGATATACTTGCTTTGTGAGGTGTTTTCATCTTTGCTGAACTTGG186(AC)13601.5ccmu168TCCGTGTCATTGCTGTGTGATTCATCTCCAACCTGTAGCACC261(AC)13601.5ccmu169TTGGCTTGTCTTCAGGGATTGAAAAGTTGGTCTCCCTTCGGT259(AC)13601.5ccmu170CAGACCACTGGATTGCAGGTTCCCGAAATGAACATATCTACCCT232(ATT)13601.5ccmu171TGCCATGTAAACATGAGAAACTAAGAGTGATCTCCAGGGATTTTTGT200(AC)13601.5ccmu172TCATCCATCTGAATCTTGGTCACAGGCACTTCTTGGCACATAGC205(AC)13601.5ccmu173GCCAGGACTACATAAGGCCACCCCCATAGACATGCCCACAAG214(AC)13601.5ccmu174CGCATAGGACAAGAGCAGGAAATTTCCACGCCACAGTCACC243(AC)13601.5ccmu175AGGGGGAGGGAGGGAGAAGCAAGCACTCCTTTAGATTACA198(AC)13601.5ccmu176GTAGGAGTCACTCAGTGGAAGAGAACTTCCCAAGTAGGAGACAGG192(AC)13601.5ccmu177AGCCAGAGCTGGATACTTAAGACAGACGAGGGTGGATAGACGTA198(AC)13601.5ccmu178ATGTCTGTTGAAGCAGGCAATGTGCGTATGTAGAGCATTTTTCC159(AC)13601.5ccmu179TTTCATGGGGACACAACCTGGACTAAGGATTGGACCTCTGGC200(AC)13601.5ccmu180TGGCTCCAGCAGTTGATGAGACAAGAAAAACAACATGCTCCTTA200(AC)13601.5ccmu181AAATGAGCGCACGCATGAGACAGGGTGCAAATGAGCAGAAG160(CA)15601.5ccmu182AGCTTGAAAGAACCAACACAGTTCTTCCCAGTTTTTCCTACCAACT217(CA)16601.5ccmu183GGGTAAAGCATCACCTGCCAAGCAGATGGCATCAGGTGTG250(CA)17601.5ccmu184TGGGCAAGTCAGTTGAAGCACATGGTGCAGATTCCCTCTGT219(CA)17601.5ccmu185TGGGTGAACTCCCAATTTTCTTCTTCATAGAAATTAACAGCTGCAT243(CA)17601.5ccmu186TCCCTTGGACTTTATGGGCAGCGCCCTCTCTAGGCCTAACTT241(CA)19601.5ccmu187AAAGCCTGTTTGGGCTACCTATCCGGTGCTCCTCACAGTA232(CAC)10601.5ccmu188CATCCCCACCAATAGGAGCCGGCCTGTTCAGTACAATCCCA184(CAT)11601.5ccmu189GCAAGTAAAGGGCTTGCAGTTGCCCTTAAGCATGGAAAGGA247(CAT)12601.5ccmu190ACGAGTTCTCCCCTAGCACAACTGTCTCCTTGGACAAGCC247(CAT)13601.5ccmu191ACTCCCATGGTCCTTTTGCCAAAGCCCTTAAGAAGCTGGGTT172(CTT)11601.5ccmu192CTGCTTCAGAGGAAAGGCAGAGCATCCAGATGGTGGTCCTTT217(AC)15601.5ccmu193CCCTCTCTAGGACTGTGCAATGCTCCAGCCCATCAATTAGG186(AC)15601.5ccmu194GCATTGGGGAAGGGCAATAGCACACCCAAGTGTTCAGGGT238(AC)15601.5ccmu195CACACCACACAGCCTAACCATCAGCCTGTGGGAACATTGAA240(AC)15601.5ccmu196TCTACTCCTTCTTTCCCCCTCCTTCGCCTTGTCTCTGTGAGAAT155(AC)15601.5ccmu197CGGCCTCAGTCACAACACATCCTTGTCTTTGTGGTTGATCCAT174(AC)15601.5ccmu198GCTTGTACCTTGGAAAGCTGGTGTTTCGTATGCTCACTTGCC150(AC)15601.5ccmu199ACTCCTTTTCACTCTCTTTGGATGTAGGGGGAGCTCATTTTGGA196(AC)15601.5ccmu200AAACCAAACCAAAAACACACTCCTTCTCCACCCAGGTCCTACAA169(AC)15601.5ccmu201CAGTTCACATCTGTGGGCAAAACCGCTAGAGGGCAGAGAAA240(AG)13601.5ccmu202TGATTTGCATGCATACTTCCCTCAACACTCCTGTCCTGCTGT259(AG)13601.5

(續(xù)表1)

位點Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu203AGTGGCTGGAAACAACCCAACCTCTCACTGAACCAACGTCA318(AG)13601.5ccmu204ACTCCTACATTGAAGCCGTCTCGGTCACTATGGCCCCAGAAG222(AG)13601.5ccmu205GGATTGTGTCTGCAGGTCAGTATGATGCACCAGCCATAGGTT241(AG)13601.5ccmu206TGAGTGACTTGAGTGACAGTACCTGTGACTGGATGAGGCTTGC224(AG)13601.5ccmu207TCAGGAAAACCAAAACAAATTGGAACTTTCCTTTCCCCACCGGAT302(AG)13601.5ccmu208GAGCTGTGTGAGGACCAGTTTGTCTGAGTGCTTTGACAACGTAT172(AC)5601.5ccmu209CAGCCCCAAGCCAAAGGTTTTTGCCAACTGGGTGGGATAAGA200(AC)5601.5ccmu210GACAGGCTCTAGCAGCAGAAATACAGTCACAGGAGAGTGCT186(AG)13601.5ccmu211CTTCTGATCATTCCCTGCGTGTCTCTGGTGCCTGCCTCTAA152(AC)13601.5ccmu212CTGTTCACCATTCACTTAACACCAAGGCTGATGAAAGTTGCCCT156(AC)13601.5ccmu213TACAGAACACAGATATTGGGCACATACACCCACCTCAAATGCG199(AC)5601.5ccmu214TCCCTATGCCTCTTCCCTAGTCTAGTAAGAGGGGCAGGGGATG170(AC)5601.5ccmu215GAGGGACCATAGGAAGCAGAAGACTCCCACATGTCACCCCA52(AC)5601.5ccmu216TTCACAGGTACAGTCATGGGCCAACAAGTGGTCTTGTCAGAAA63(AC)5601.5ccmu217TCTTGCTCTCTATCCCTCTCCATCCAGACTCAGAAAGGCAACC126(AC)5601.5ccmu218AGTAGCCATTTGCATGAGGACATTCCCTAGTGATCTATTGGGTTGG137(AC)5601.5ccmu219TGACTCTTGTGAGCTATCCTCTGTGCTACCTTCTGTCCTCCTCA180(AC)5601.5ccmu220CACGCAGGTGCTTATCTCCACAGGGTGAACAGAACGAGGT136(AC)5601.5ccmu221ACCCTCATTTCATACCCTGCCATTGGCCATTGGGCATAGCA271(CA)20601.5ccmu222AAAACTCCTCGGGAAGGTGGACGAATTTGGGGCGCATAAG289(CA)20601.5ccmu223ATGCCTGTGTTGTATCAGGCTCCAGGTTTTCCCAGGTTCAC208(CA)20601.5ccmu224TGCTGACCCCTACTCACAGTGCCTTGGTTCTTAGAAAGCCC246(CA)20601.5ccmu225TATGGTTCTTGCAGAGGGCGTGCATGGAAATTGATCCGCT283(CA)20601.5ccmu226CCCGGGGTCTGTGTACAATCAGCTGTCGTCTTGACTGTGTT240(CA)20601.5ccmu227ATGTTAACCACCACGGGTCCCGTGTCCAGTAGGAGGTTGT249(CA)20601.5ccmu228TAAACAAGAGCTGGGTGCCTCCCCTCATGGGCAGAACGAA300(CA)20601.5ccmu229TTGCGATGCACATGAAGTGATTTTATCCTCCGTGCTCCCG232(CAC)12601.5ccmu230ACATGTTTCCAATTGGGCTGCACTGCTTTCAGAATGGATTTTTGT239(CA)20601.5ccmu231GTCTGGGCTTGTCTAGGTGCTCCCAGGACTGTGGCCTATT242(TC)22601.5ccmu232TGACAACAGCCAGCACAGAGCCAGATTGGTTCCAAACAGCAG259(TC)22601.5ccmu233AGTCACGCGGGAGTAGAACTGCTCTCCTTGTGGAGACCCT191(TC)22601.5ccmu234AATGGGGGCCATCTTCTCCACGCTGTCTTGTGTGTCATCC177(TC)22601.5ccmu235CCTGGTGTACTCCATTTGCTCTGTGCGTTGTCCAGTTGTCTT243(TC)22601.5ccmu236GAAGAGGCTACACGATGGGGAGCCTTGGTGTTTCAGTTTCA231(TC)22601.5ccmu237CTCCTGTGCAGGCACACTTAGATCCCAGCACCCACAGAAG307(TC)22601.5ccmu238TGTGTCAGCCATAAGTCCCCAACTGGGGCACTGTCAACAT279(TC)22601.5ccmu239ACACCATGGATAAAGACCCTGTAAACTTTCTTCAGCTTCCACT114(TC)22601.5ccmu240TGTGGGATACTGGTGCACTGCTGCTTTCCAGTTGTGGTGC234(TC)22601.5ccmu241CTGTTAGCACGGGACTGACTAGACATTATGGCTTGTTCCCCA226(TC)22601.5ccmu242GATGCCTGGTCCCCAATCTTCTGTTCGAGAAATGGCCACC287(TC)22601.5ccmu243GCCTCGTTGGAGAAAGTGTGAAGACACCATGACCACAGCAA164(TC)22601.5ccmu244GGGCCAGCTGATGCTTAGATTTGGTGCTAACATTCCTGGCA144(TC)22601.5ccmu245CCACTGCCACTGTTTACCCAGGTCTGTCTGTTAGATCTGCCAAT277(TC)22601.5ccmu246GGACTTGTGGCCTTGTAGGAGGGTCATCGTGGAGAGCATGG272(TC)22601.5ccmu247AGGTATGGCCTCGTTAGAGGAGTGTCAGAGGGTTAGAGTCCAT232(TC)22601.5ccmu248TACCTGGAGGGGCAGCTAAAGATCATGCCTAAGGGGGAGG343(TC)22601.5ccmu249GAGTTGGGAAAACTCAGCGTTCCCAAGTTTTCTTTTTCATCACTG245(TC)22601.5ccmu250TCCCTAGACCTGCAAAACCACACCCCCATCCCAAGATTCCTA214(TC)22601.5ccmu251TTGTGTCTAATTCCCTCCTCCCGTGCTTCTCTACCGGGTACT152(CA)22601.5ccmu252CCTAGACAGAAACAAGGGCCACCCCACAAAGCACTGATTAGC224(CA)22601.5ccmu253ACTGGGGACCATGGTAAGTCTATTACCTTTGTGGAGTACTTGGT277(ATT)3601.5

(續(xù)表1)

位點Loci引物序列(上游)(5’→3’)Primer sequences (upstream)引物序列(下游)(5’→3’)Primer sequences (downstream)目的片段大小(bp)Target sequence size核苷酸類型和重復次數(shù)Nucleotide type and number of repetitions退火溫度(℃)Annealing temperatureMg2+濃度(mmol/L)Mg2+concentrationccmu254TCTGAGTGAAACGTAAGTACACCTAGTTTCTGCTCTCTGACATGGA210(ATT)3601.5ccmu255ACCAACTATTCCCACTGAGACAGCTTACCACAGACATTCCCCA240(ATT)3601.5ccmu261TTTGGGCAGTTCACCACGATGTCCCGCCTGTTTGAAGGTA316(GA)11601.5ccmu262AGTGTGTCCGTGTCTTCCTTCAGGAGAAATCCAATGCTGTGC146(GA)9601.5ccmu263AGGCTACACCATACCTGACCTCTGAGTCTGGAGTCTGCTGT249(GA)18601.5ccmu264AGGCTAGCTTCTGGATGCACGTAGGTCTCCAGATCAAGGGC249(GCT)10601.5ccmu265TGGGTAGGATGGCAGGGATATATGACTCCTGGGCAGTTGTTT161(GCT)10601.5ccmu266ACCACCACCTCCAAAGAACTGACAATGCCACCTCCCTGAAT151(AC)15601.5ccmu267ACTTGAGATTCTTCAGCAGCAAATCTCAGTCAGTGACACTCAAA200(AC)15601.5ccmu268TCCCAAGTGCGCAGTCATAGACCCTGTGTGTTTCTCCAAAGT225(AC)15601.5ccmu269GCTCCAAACACAGGGCGATAAGGGTCCCTGGTATCTGAGT247(AC)15601.5ccmu270CCCATACATTCCTCATTGCACTGCCACTGAGGCTTCATTCAT221(AC)15601.5

注：A：引物ccmu138的PCR產(chǎn)物；B：引物ccmu218的PCR產(chǎn)物。M：50 bp marker；A1 ～ A6：長爪沙鼠腦缺血模型；B1 ～ B6：長爪沙鼠糖尿病模型。圖2 兩個微衛(wèi)星位點 ccmu138和ccmu218的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Note. A, PCR product of ccmu138 primers. B, PCR product of ccmu218 primers. M, 50 bp marker. A1-A6, Cerebral ischemia Mongolian gerbils. B1-B6, Diabetic Mongolian gerbils.Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products for loci ccmu138 and ccmu218

2.2 適于長爪沙鼠近交系區(qū)分的微衛(wèi)星位點優(yōu)化

選取本課題組自行培育的長爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系F20代動物各6只，通過135個微衛(wèi)星位點擴增結(jié)果分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各位點在同一品系內(nèi)均呈單態(tài)性，而有10個微衛(wèi)星位點在2種模型品系間存在差異，包括ccmu138、ccmu146、ccmu156、ccmu161、ccmu175、ccmu189、ccmu218、 ccmu235、ccmu250和ccmu261。這些位點可將長爪沙鼠2種模型近交系品系區(qū)分開來，圖2為2個位點對不同近交系的擴增結(jié)果。

2.3 微衛(wèi)星位點多態(tài)性優(yōu)化

應用135個篩選出的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點引物對12只封閉群長爪沙鼠樣本進行擴增，結(jié)果有23個微衛(wèi)星位點出現(xiàn)多態(tài)性，包括ccmu148、ccmu151、ccmu163、ccmu164、ccmu165、ccmu176、ccmu183、ccmu187、ccmu190、ccmu192、ccmu198、ccmu201、ccmu214、ccmu231、ccmu232、ccmu233、ccmu241、ccmu244、ccmu248、ccmu249、ccmu264、ccmu267和ccmu269微衛(wèi)星位點，圖3顯示ccmu148和ccmu176位點對12只封閉群動物的擴增結(jié)果，兩個位點在封閉群多個樣品中顯示多態(tài)性。

3 討論

微衛(wèi)星DNA也稱為簡單重復的DNA片段，其重復單位一般為1 ～ 6 bp，重復數(shù)為10 ～ 20次左右，在哺乳動物基因組中隨機分布。由于其具有在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、易于檢測、共顯性遺傳等優(yōu)點，成為第二代遺傳標記物。微衛(wèi)星在評價遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、繪制系統(tǒng)發(fā)生樹、連鎖分析、疾病診斷和親子鑒定等方面顯示出巨大優(yōu)勢，并在動植物的遺傳研究中得到了廣泛應用[11-12]，并成為一種重要的、成熟的遺傳學檢測工具廣泛應用于各類實驗動物遺傳質(zhì)量檢測研究中[13-14]。

注：A：ccmu148引物的PCR產(chǎn)物；B：ccmu176引物的PCR產(chǎn)物。M：50 bp marker；1 ～ 12：封閉群長爪沙鼠。圖3 兩個微衛(wèi)星位點ccmu148和ccmu176的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Note. A, PCR product of ccmu148 primers. B, PCR product of ccmu176 primers. M, 50 bp marker. 1-12, outbred group of Mongolian gerbils.Figure 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products for the loci ccmu148 and ccmu176

微衛(wèi)星DNA標記在大、小鼠遺傳多態(tài)性的研究已經(jīng)取得較好成果，但長爪沙鼠開發(fā)出的微衛(wèi)星位點數(shù)量較少。除Neumann等[1]通過用克隆方法找到的9個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點外，本實驗室利用種間擴增轉(zhuǎn)移法，在536對小鼠微衛(wèi)星引物中篩選出了長爪沙鼠微衛(wèi)星位點 130 個，并已登錄到GenBank中[2-3]。我們利用國內(nèi)外篩選的139個微衛(wèi)星位點通過封閉群長爪沙鼠進行多態(tài)性分析，優(yōu)化出了28個具有多態(tài)性的位點，以此為依據(jù)建立了封閉群長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法，并被浙江省和北京市長爪沙鼠遺傳質(zhì)量控制地方標準和中國實驗動物行業(yè)標準所采納[4-6]。在建立長爪沙鼠遺傳檢測方法時，由于可供選擇的位點數(shù)量少，為了能真實地反映群體遺傳概貌，不得采用更多的位點組合，使一些僅有2個等位基因的位點也納入了其中。這大大增加了工作量，也使得檢測周期延長和耗費過多。同時，以往尚未見有對近交系長爪沙鼠遺傳檢測方法的研究報道，因此有必要篩選更多的長爪沙鼠微衛(wèi)星位點為下一步補充和完善目前的長爪沙鼠遺傳檢測方法及建立近交系長爪沙鼠遺傳檢測方法提供候選位點。

本研究中我們通過分析長爪沙鼠全基因組的測序結(jié)果，選擇符合微衛(wèi)星標準的位點357個，并根據(jù)微衛(wèi)星位點的側(cè)翼序列合成相應的引物，能夠針對性地篩選適用于長爪沙鼠的微衛(wèi)星位點，優(yōu)于實驗室前期利用種間擴增轉(zhuǎn)移的方法。我們首先用長爪沙鼠混合基因組對位點進行PCR擴增，在357個微衛(wèi)星位點中成功擴增出135個條帶清晰且無雜帶的微衛(wèi)星位點，包括112個二核苷酸位點和23個三核苷酸位點。其余222個微衛(wèi)星位點沒有擴增出理想條帶，擴增失敗的原因可能為以下方面：所設(shè)計的引物特異性不佳，形成引物二聚體從而產(chǎn)生非特異性擴增條帶；模板DNA的質(zhì)量也能影響個別位點的擴增，尤其是對相對較長的微衛(wèi)星片段的影響更加明顯。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)長爪沙鼠近交系是腦缺血研究良好的模型動物，也是理想的II型糖尿病模型，兩種模型的建立不但豐富了實驗動物資源，也為研究人類疾病的機制與藥物開發(fā)提供良好的模型材料。所以本研究利用篩選出的135個微衛(wèi)星位點分析已知的長爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系動物進行驗證，結(jié)果多數(shù)位點為單態(tài)性，尤其在同一品系內(nèi)均為一致的電泳圖帶。而2個品系間有10個微衛(wèi)星位點存在差異，能區(qū)分長爪沙鼠腦缺血和糖尿病模型近交系群體，對于模型動物的推廣應用具有重要的意義。由于這2個近交系均來源于20代前的共同父母，是在F7代時分離培育成2個品系，因此遺傳背景很大程度上是一致的，以往的遺傳檢測方法很難將其區(qū)分，說明這10個位點可用于近交系的遺傳監(jiān)測。遺傳多樣性是生物多樣性的核心和重要組成部分，對遺傳多樣性的研究有利于了解物種或種群的進化歷史和分類地位，為資源的保存與利用提供理論依據(jù)。封閉群動物群體中存在遺傳多樣性，選擇用于群體遺傳分析的微衛(wèi)星位點更加注重其多態(tài)性，即等位基因數(shù)量越多，其所蘊含的信息量越大，遺傳分析的結(jié)果更加真實可靠。為了建立有效的長爪沙鼠群體遺傳檢測方法，開展長爪沙鼠群體遺傳多樣性分析，本研究隨機選取了長爪沙鼠封閉群動物12只，應用篩選出的135個微衛(wèi)星位點進行擴增，結(jié)果有23個多態(tài)性位點，一共發(fā)現(xiàn)了63個等位基因，其中等位基因數(shù)最多的達6個。這為補充和完善封閉群長爪沙鼠遺傳質(zhì)量檢測方法提供了新的可供選擇的微衛(wèi)星位點。