方熹雅， 劉 潔， 張春蘭， 賴振宇， 李世鵬， 吳 菲， 周子惠， 雷初朝， 黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

1 非編碼RNA研究背景

1.1 miRNA

miRNA(microRNAs)，又稱為微小RNA，是長度為18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，miRNA不參與編碼蛋白質(zhì)，主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達。miRNA廣泛分布在真核生物體內(nèi)的不同的細胞系中，相同miRNA家族中的各miRNA在不同的物種中進化的保守性是一致的；同時，不同物種中miRNA對不同生物過程生物的調(diào)節(jié)也是不同的。microRNA通過使自身5′端非編碼區(qū)域的一段序列以堿基互補配對的方式與在靶向蛋白基因3′端非翻譯區(qū)(UTR)之前的靶向蛋白編碼基因相結(jié)合，從而影響轉(zhuǎn)錄出的mRNA的穩(wěn)定性，即對其進行裂解，或干擾蛋白質(zhì)的翻譯過程。越來越多的研究表明，miRNA控制著許多的生命過程，在調(diào)控正常生命活動和疾病方面有著不容忽視的影響，至少超過1/2以上的功能基因都可以被相關(guān)的miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平進行一定的調(diào)控，包括各種不同的信號通路[1]。

1.2 其他ncRNA

除了miRNA家族之外,非編碼RNA還包括rRNA、tRNA、snRNA、siRNA等。它們功能繁多，積極參與生物體基因表達和關(guān)閉，蛋白質(zhì)合成，細胞增殖等各項生命活動。例如gRNA在mRNA轉(zhuǎn)錄中起到指導(dǎo)作用；tmRNA既可以起到與mRNA相似的模板作用，又可起到與tRNA相似的轉(zhuǎn)運作用；snRNA在mRNA前體剪接體中的擔任重要的組成成分；snRNA參與rRNA的修飾；siRNA可對特定mRNA的降解進行指導(dǎo)等[2-3]。

1.3 神經(jīng)嵴細胞研究背景

神經(jīng)嵴是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中在神經(jīng)板彎曲形成神經(jīng)管時部分邊緣細胞形成的胚胎發(fā)育中的一種過渡性結(jié)構(gòu)。神經(jīng)嵴細胞經(jīng)誘導(dǎo)后可遷移，并可分化成軟骨細胞、骨細胞、神經(jīng)元細胞、黑色素細胞、和平滑肌細胞等[2]。神經(jīng)嵴細胞的分化是一個由多個信號通路控制的復(fù)雜過程，包括Wnt、Fgf和Bmp通路[3]。Bmp信號在決定神經(jīng)嵴分化方向中起著核心作用[4-5]。在軟骨形成過程中，I型受體Bmpr1a和Bmpr1b或受體激活的Smads 1，5和8會導(dǎo)致軟骨細胞增殖、分化和存活受到損害，造成嚴重的軟骨發(fā)育異常[6]。因此神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育對神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)以及心臟、顱面等組織有重要作用，所以近年來對于神經(jīng)嵴細胞的研究越來越多。研究表明，神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常會導(dǎo)致多種疾病。以PAX3和SOX10為中心的基因互作引起的神經(jīng)嵴細胞功能異常會導(dǎo)致綜合征型耳聾[7]。先天性巨結(jié)腸(HSCR)也是由于在胚胎時期神經(jīng)嵴細胞向腸管的定向遷移發(fā)生障礙而引起的[8]。此外，家族性神經(jīng)母細胞瘤，DiCeorge綜合征等疾病均與神經(jīng)嵴細胞發(fā)育異常有關(guān)。除此之外一些非編碼RNA也對其發(fā)育有作用[9]。神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育對多種組織器官等都有影響，因此相關(guān)研究對于神經(jīng)嵴細胞發(fā)育障礙相關(guān)疾病的治療有重要的意義。

2 非編碼RNA對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的調(diào)控作用

2.2 miRNA對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的調(diào)控

目前研究較為廣泛和深入的是miRNA在軟骨細胞神經(jīng)嵴譜系分化中的作用。在顱神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育中，Oct4，Sox2等葉酸受體α一方面通過與啟動子區(qū)域結(jié)合來上調(diào)顱神經(jīng)嵴細胞中的多能性標志物，另一方面自身調(diào)節(jié)miR-138和miR-let-7，MiR-138靶向Oct4，miR-let-7靶向Trim71，來調(diào)節(jié)顱神經(jīng)嵴細胞的增殖，以使顱神經(jīng)嵴細胞在分化前保持其多能性表型和增殖潛能[10]。而miR-873被Koufaris等人使用生物信息分析方法證明參與Hedgehog信號傳導(dǎo)的調(diào)控，Hedgehog信號通路是顱面形態(tài)形成和分化的重要途徑。其可能靶標為ZIC2，然而仍需要在動物模型中進行進一步研究來確認miR-873的調(diào)節(jié)作用[11]。

在斑馬魚模型上的實驗發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中存在2個mir92a，mir92a-1和mir92a-2雖然序列相同，但分別由mir17-92簇和mir106a-92簇編碼。miR-92a的失活增加了咽部區(qū)域的Nog3水平，咽部軟骨形成祖細胞的細胞增殖，分化和存活顯著減少，導(dǎo)致咽部軟骨的損失[12]。Ning等通過雙熒光原位雜交以及向斑馬魚胚胎中注入92a-MO的方法研究發(fā)現(xiàn)，mir92a可以通過靶向noggin3解除BMP信號并誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡影響顱面部發(fā)育[12]。Wang等應(yīng)用了3'UTR熒光素酶報告基因以及位點突變的方法，對mir17-92對于唇腭裂的影響進行研究。結(jié)果表明，小鼠體內(nèi)miR-17-92簇的缺失會導(dǎo)致顱面畸形[13]。此外，研究表明mir-17-92簇直接抑制了在顱面發(fā)育過程中具有重要的功能的T-box因子。并且進一步證明，miR-17-92是由BMP信號和轉(zhuǎn)錄因子AP-2α直接激活的。miR-27則靶向粘著對軟骨的形成有負調(diào)節(jié)作用的整合素介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)粘附的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子斑激酶Ptk2aa[14]。Kara等人對miR-27的敲除實驗證明miR-27可下調(diào)咽弓中的Ptk2aa，促進軟骨細胞分化。miR-27的缺失可導(dǎo)致軟骨原細胞的增殖和分化受損。王冬玥等人則使用斑馬魚模型在顯微鏡下注射mir-1反義核苷酸(MO)抑制mir-1，觀察下頜骨的生長情況并利用整體TUNEL染色技術(shù)和pH3免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)mir-1對于神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育具有正向調(diào)控作用[9]。魏安瑤等人通過在斑馬魚胚胎中注射與其miRNA-23a序列完全互補的MO以抑制斑馬魚胚胎內(nèi)源性miRNA-23a的活性，并通過阿爾新藍染色法以及原位雜交法觀察低表達的miRNA-23a對斑馬魚顱面部軟骨發(fā)育的影響時發(fā)現(xiàn)低表達的miRNA-23a會導(dǎo)致斑馬魚胚胎的咽區(qū)軟骨缺失，為了進一步確認miRNA-23a在神經(jīng)嵴細胞向斑馬魚咽部遷移過程中的作用，采用激光共聚焦顯微鏡拍攝并對結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)miRNA-23a抑制神經(jīng)嵴細胞從后腦向咽部遷移并導(dǎo)致其不能分化成為軟骨細胞，從而導(dǎo)致了斑馬魚胚胎的咽區(qū)軟骨缺失[15]。

在對神經(jīng)嵴衍生細胞譜系的研究中，王艷華等人采用流動分選法分離人毛囊神經(jīng)嵴干細胞定向誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)過程中分為對照組，加入mir-21激動劑組，加入mir-21抑制劑組，無活性的microRNA類似物組，qRT-PCR檢測mir-21表達水平。結(jié)果表明，mir-21的表達水平在毛囊神經(jīng)嵴干細胞分化過程中逐漸升高。轉(zhuǎn)染對mir-21有激活作用的agomir-21后，干細胞分化為schwann細胞的能力增強，轉(zhuǎn)染mir-21抑制劑antagomir-21后干細胞分化的能力減弱。證明mir-21可以促進神經(jīng)嵴干細胞向schwann細胞分化[16]。

神經(jīng)嵴衍生的交感腎上腺細胞譜系產(chǎn)生交感神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)的內(nèi)分泌嗜鉻細胞，兩種細胞表達了大量重疊的基因。miR-124在發(fā)育的交感神經(jīng)元中是可檢測的，但在嗜鉻細胞前體中不存在。Stella等人證明了miR-124在轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的嗜鉻細胞中時促進神經(jīng)突伸長，表明miR-124可以促進在非神經(jīng)元交感腎上腺細胞中建立神經(jīng)元形態(tài)[17]。進一步研究發(fā)現(xiàn)用神經(jīng)營養(yǎng)素神經(jīng)生長因子治療PC12細胞會導(dǎo)致miR-124表達上調(diào)，而抑制miR-124會降低PC12細胞中神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)突的生長。表明miR-124有助于在發(fā)育中的交感腎上腺細胞中建立特定的神經(jīng)元特征[17]。

在對神經(jīng)嵴細胞凋亡過程的研究中，Chen等人將神經(jīng)嵴細胞暴露在不同濃度的乙醇中，發(fā)現(xiàn)體外和體內(nèi)乙醇處理均可顯著降低胚胎細胞或組織中miR-125b的表達，暴露于50 mM乙醇導(dǎo)致Bak1蛋白和PUMA蛋白表達顯著增加，表明miR-125b的直接靶點Bak1和PUMA參與了乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)嵴細胞凋亡[18]。同時用乙醇處理miR-125b模擬物轉(zhuǎn)染的神經(jīng)嵴細胞，發(fā)現(xiàn)miR-125b模擬物過表達miR-125b可抑制乙醇誘導(dǎo)的Bak1蛋白表達增加。miR-125b水平的上調(diào)也降低了暴露于乙醇的神經(jīng)嵴細胞中PUMA蛋白的表達。此外，用miR-125b模擬物處理大大降低了神經(jīng)嵴細胞中乙醇誘導(dǎo)的caspase-3活化。表明miR-125b參與乙醇誘導(dǎo)的細胞凋亡，并且miR-125b的過表達可以阻止乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)嵴細胞細胞凋亡[18]。

神經(jīng)嵴細胞在原腸胚形成期間在外胚層中被誘導(dǎo)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中外胚層形成的神經(jīng)板分化成神經(jīng)管以及神經(jīng)嵴[19]，發(fā)育后期，神經(jīng)管構(gòu)成整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)嵴細胞則可以繼續(xù)分化形成外周神經(jīng)系統(tǒng)的細胞[20]。Xi等利用胚胎干細胞神經(jīng)分化系統(tǒng)的研究表明在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育初始階段Pou3f1-miR-29b-Dnmt3a軸非常活躍，即mir-29b可以通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(Dnmt3a)以及轉(zhuǎn)錄因子Pou3f1調(diào)節(jié)胚胎干細胞分化成神經(jīng)管并抑制其向神經(jīng)嵴細胞方向的分化[21]。Nicole等人使用源自非洲爪蟾胚胎的外胚層移植體的文庫進行測序，同時對外胚層和囊胚階段組織進行測序，發(fā)現(xiàn)miR-301a，miR-338和miR-427以及5種miR-427在不同組織中差異表達的亞型或異構(gòu)體在所有4種組織類型中高度表達[22]。表明這些miRNA對于維持神經(jīng)嵴細胞的干細胞樣表型具有一定作用(表1)。

表1 近5年已證明與神經(jīng)嵴細胞發(fā)育有關(guān)的miRNA及其靶點

2.3 其他ncRNA對神經(jīng)嵴細胞增殖分化的調(diào)控

近幾年來，更為廣泛的研究顯示除miRNA外lncRNA Pnky，BDNF-As等非編碼RNA對神經(jīng)嵴細胞的增殖分化也具有一定的調(diào)控作用。Liu等人采用RT-PCR技術(shù)分析了HA117在不同結(jié)腸段的表達情況，利用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測HA117在腸壁的分布，發(fā)現(xiàn)一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)的視網(wǎng)膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄本HA117參與了HSCR的發(fā)生，并在其中起到了抗分化作用[24]。Ramos等發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)特異性長鏈非編碼RNA-Pnky。Pnky主要與剪切調(diào)節(jié)因子PTBT1相互作用，相關(guān)敲低實驗表明，Pnky可以促進神經(jīng)嵴細胞的分化，降低增殖[25]。另外，Modarresi等研究發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因(BDNF)的非編碼反義RNA轉(zhuǎn)錄物(BDNF-As)可以通過改變BDNF位點上的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來抑制RNA轉(zhuǎn)錄，從而降低內(nèi)源性BDNF蛋白的水平，對神經(jīng)嵴細胞的生長、成熟以及分化等起到了一定的作用[26]。Walter等人發(fā)現(xiàn)人環(huán)狀RNA與小腦退化相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄本(CDR1as)反義，CDR1as在神經(jīng)元組織中極易與miR-7結(jié)合，吸附并抑制miRNA-7的正常功能，從而影響神經(jīng)嵴細胞發(fā)育[27]。

3 小結(jié)與展望

本文介紹了與神經(jīng)嵴細胞發(fā)育、分化、凋亡有關(guān)的非編碼RNA近年來的研究進展，并以miRNA以及其他非編碼RNA在神經(jīng)嵴細胞誘導(dǎo)，軟骨細胞神經(jīng)嵴譜系分化，神經(jīng)嵴衍生細胞譜系分化，神經(jīng)嵴細胞凋亡等幾個過程中的作用為落腳點，收集整理了近5年經(jīng)試驗證實與神經(jīng)嵴細胞發(fā)育具有相關(guān)性的miRNA和其他非編碼RNA及其靶基因，但是仍有部分miRNA還未發(fā)現(xiàn)或證實其靶點。此外還有許多已被證實對體內(nèi)其他細胞組織發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用的miRNA,其對神經(jīng)嵴細胞發(fā)育的作用仍然有待探索和研究。神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育是一個受多種信號通路調(diào)控的復(fù)雜過程，發(fā)育異常則會導(dǎo)致綜合征型耳聾，神經(jīng)母細胞瘤，DiCeorge綜合征等疾病。因此相關(guān)研究對于神經(jīng)系統(tǒng)，肌肉系統(tǒng)以及心臟、顱面等組織的發(fā)育異常疾病的治療具有重要意義。