史穎超， 項(xiàng)門們， 汪富文， 李思華， 史芯蓓， 雷初朝， 黨瑞華*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

水牛(Bubalus babulis)是世界牛遺傳資源的重要組成部分，其主要分布在亞洲地區(qū)且飼養(yǎng)數(shù)量占據(jù)該地區(qū)90%以上，根據(jù)亞洲水牛的外形特征、生活習(xí)性和生產(chǎn)用途將其分為沼澤型和河流型兩種類型，是熱帶和亞熱帶地區(qū)獨(dú)具特色的一個(gè)物種[1-2]。在中國(guó)，水牛在數(shù)量上僅次于黃牛，排名第二。作為貴州所特有的水牛品種，貴州白水牛主要產(chǎn)自黔北地區(qū)，具有被毛顏色獨(dú)特、抗病力強(qiáng)、役用性能好、屠宰性能高、繁殖性能良好等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)《貴州省畜禽品種志》記載貴州的水牛屬于沼澤型水牛，灰色被毛的水牛占到總數(shù)的73.19%，少部分為白色，占總數(shù)的5.7%[3]，其中白色對(duì)灰色表現(xiàn)完全顯性。近年來(lái)，由于不科學(xué)的選育與保種不當(dāng)、近親交配等原因，導(dǎo)致白色被毛水牛品種嚴(yán)重退化，群體數(shù)量不斷遞減[4]。皮、毛的顏色作為家畜最直觀的外部表型，不僅對(duì)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有很大影響，還是品種的重要特征之一，與毛色性狀相關(guān)的候選基因多態(tài)性不僅是可以利用的良好遺傳標(biāo)記，在確定雜交組合和品種純度等方面也有重要用途，此外還有研究表明動(dòng)物的毛色與乳、肉等生產(chǎn)性能有直接的關(guān)系[5]，對(duì)毛色與疾病的相關(guān)性研究也為診斷和治療相關(guān)疾病提供了理想的參考。本試驗(yàn)旨在分析貴州白水牛的白色被毛形成的內(nèi)在分子機(jī)制，以豐富對(duì)其品種資源遺傳特征的認(rèn)識(shí)，為今后白水牛品種的保種和選育提供科學(xué)的指導(dǎo)。

牛的毛色主要是由皮膚和毛發(fā)中的真黑色素(褐與黑)與偽黑色素(紅與黃)的相對(duì)數(shù)量與分布情況所決定的[6]。許多研究表明，ASIP基因、MC1R基因和TYR基因是控制牛、羊等哺乳動(dòng)物毛色的重要主效基因，這些基因的突變可能引起動(dòng)物毛色性狀的改變，故本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)這3個(gè)基因的多態(tài)性研究，試圖從中分析得到貴州白水牛白色被毛形成的原因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在不同品種飼養(yǎng)管理?xiàng)l件基本相同的情況下選取健康無(wú)病、精神狀態(tài)良好、被毛光澤、顏色均一的水牛為樣本，40頭貴州水牛(20頭貴州白水牛和20頭貴州灰水牛)選自貴州省遵義市鳳崗縣養(yǎng)殖廠的水牛個(gè)體，剪取耳組織為樣本；40頭普通黑水牛采取隨機(jī)抽樣的方式從宜賓水牛育種場(chǎng)采集血樣，每頭牛采集10 mL頸靜脈血樣置于抗凝血采血管中，震蕩混勻后置于-80 ℃保存。

1.2 提取DNA和構(gòu)建DNA池

血液樣本采用全血/組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒，提取血液基因組DNA；耳組織樣本采用磁珠法動(dòng)物組織基因組DNA抽提試劑盒提取其DNA，用NanoDropTM 1000 Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)DNA濃度及純度(OD260/280，OD260/230)，并將水牛DNA樣品的濃度調(diào)整至50 ng/μL。從10頭貴州白水牛的DNA樣品中各取5 μL混合在一起構(gòu)建貴州白水牛的DNA池，從10頭貴州灰水牛耳部肌肉組織樣DNA中各取5 μL均勻混合在一起構(gòu)建灰水牛的DNA池，從20頭宜賓水牛頸靜脈血樣DNA中各取5 μL混合在一起構(gòu)建普通黑水牛的DNA池。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中提供的水牛(buffalo)ASIP基因序列(NC_037558.1)、MC1R基因序列(AC_000175.1)、TYR基因序列(AC_000186.1)，用Primer 3.0 Plus軟件設(shè)計(jì)這3個(gè)基因的啟動(dòng)子、外顯子、3′-UTR和5′-UTR的特異性引物，引物由上海生工Sangon Biotech生物公司合成(詳見(jiàn)表1～3)。

PCR反應(yīng)總體系25 μL，其中ddH20 9.5μL，Mix(包括PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑、Mg2+、dNTPs、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer))12.5 μL，上游引物F和下游引物R各1 μL，水牛DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；設(shè)計(jì)不同的退火溫度30 s，72 ℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測(cè)，通過(guò)電泳檢測(cè)結(jié)果，判斷引物是否合適，并確定最適退火溫度。

1.4 序列測(cè)序及分析

以貴州白水牛、貴州灰水牛和普通水牛分別構(gòu)建的DNA池作為DNA模板進(jìn)行特定部分PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行正、反測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用SeqMan進(jìn)行對(duì)比分析尋找突變位點(diǎn)。

1.5 擴(kuò)大樣本驗(yàn)證

針對(duì)以DNA池為模板檢測(cè)出來(lái)的突變位點(diǎn)，利用剩下的10頭貴州白水牛個(gè)體、10頭貴州灰水牛個(gè)體和20頭普通水牛個(gè)體的DNA樣本為模板對(duì)突變位點(diǎn)所在的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析，對(duì)比篩選到的突變位點(diǎn)是否具有特異性，能否解釋品種間毛色的差異。

表1 ASIP引物設(shè)計(jì)

表2 MC1R引物設(shè)計(jì)

表3 引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)貴州白水牛的ASIP、MC1R和TYR基因都存在多態(tài)位點(diǎn)，以MC1R基因第一外顯子第一位堿基計(jì)數(shù)為1，貴州白水牛的SNPs位點(diǎn)為：exon 1-G617A、exon 1-T843C，這2個(gè)SNPs位點(diǎn)在貴州灰水牛和部分普通水牛個(gè)體中同樣存在，不具有特異性，詳見(jiàn)圖1；以TYR基因每一外顯子第一位堿基計(jì)數(shù)為1，貴州白水牛的SNPs位點(diǎn)為：exon 1-G826A、exon 3-A83G、exon 5-T70C和exon 4-C170A，這4個(gè)SNPs位點(diǎn)在貴州灰水牛和普通水牛中同樣存在，不具有特異性，詳見(jiàn)圖2；以ASIP基因第一外顯子第一位堿基計(jì)數(shù)為1，貴州白水牛的SNPs位點(diǎn)為：Promoter-A147T和Promoter-A235G，該突變?cè)诓糠制胀ㄋ€(gè)體樣本中同樣存在，故在白水牛品種中不具有特異性，不能解釋白色被毛形成的原因，詳見(jiàn)圖3。

B：exon 1-T843 C Q：exon 1-T843 C

B：exon 1-G826A exon 3-A83G exon 5-T70C

Q：exon 1-G826A exon 3-A83G exon 5-T70C

3 結(jié) 論

利用在線軟件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html預(yù)測(cè)貴州白水牛MC1R基因及TYR基因突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在MC1R基因中exon 1-T843C為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致纈氨酸(Val)變成丙氨酸(Ala)；TYR基因中exon 1-G826A和exon 5-T70C為錯(cuò)義突變，分別導(dǎo)致精氨酸(Arg)突變?yōu)榻M氨酸(His)、亮氨酸(Leu)突變?yōu)楫惲涟彼?Ile)，exon 3-A83G為同義突變；在ASIP的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNPs位點(diǎn)：Promoter-A147T和Promoter-A235G。擴(kuò)大個(gè)體樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證這些SNPs位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谫F州白水牛中不存在特異性，在其他非白水牛的個(gè)體中也有同樣突變，故不能解釋貴州白水牛白色被毛形成的分子機(jī)制，對(duì)其毛色形成原因的分析，有待下一步試驗(yàn)探討。

4 討 論

ASIP和MC1R是哺乳動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控毛色的2個(gè)重要候選基因，ASIP的表達(dá)會(huì)引起褐黑素的產(chǎn)生，MC1R的表達(dá)會(huì)引起真黑素的產(chǎn)生，許多研究表明，MC1R基因與ASIP基因共同通過(guò)控制紅/黃褐黑素和黑/棕真黑素之間的相對(duì)數(shù)量，從而控制動(dòng)物的毛色[7]。一方面ASIP基因編碼Agouti信號(hào)蛋白(agouti signaling protein,ASIP)[8]，ASIP是一種旁分泌信號(hào)分子，對(duì)G蛋白共軛型受體有天然的拮抗作用，以競(jìng)爭(zhēng)方式對(duì)黑色素細(xì)胞刺激激素受體(MSHR)起拮抗作用，引起環(huán)腺苷酸水平下降而產(chǎn)生棕黑素；另一方面，ASIP還可以下調(diào)MC1R信號(hào)，通過(guò)氨基末端，降低TYR和Dct(多巴色素異構(gòu)酶)水平[9]，通過(guò)以上這2種方式，ASIP使真黑素合成過(guò)程停止，轉(zhuǎn)為合成褐黑素，從而使皮毛表現(xiàn)為黃色或紅色。此外，ASIP基因還編碼一種Agouti基因相關(guān)蛋白(agouti-related protein, AgRP)，AgRP的N末端可以除去與ASIP具有高親和性的MC4R，使ASIP產(chǎn)生生理作用，從而達(dá)到與ASIP共同調(diào)節(jié)動(dòng)物毛色的功能[10]。結(jié)合國(guó)內(nèi)和國(guó)外已有的研究表明，MC1R基因是調(diào)控牛毛色的重要候選基因之一，具有不同MC1R基因型的牛，其毛色存在差異。早期的研究發(fā)現(xiàn)，牛MC1R基因有ED、E+和e 3種基因型，F(xiàn)rancois等在2000年通過(guò)COP-PCR的方法在牛中還檢測(cè)到一種新的基因型E1[11]。TYR基因是編碼酪氨酸酶的基因，酪氨酸酶是黑色素形成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量和活性決定了黑色素生成的速度和多少。黑色素是多巴醌、吲哚-5,6醌和多巴色素的聚合物，酪氨酸酶正是把酪氨酸轉(zhuǎn)化成多巴的中介，多巴再被氧化成多巴醌，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N衍生物組合構(gòu)成黑色素。鑒于酪氨酸酶對(duì)黑色素形成的重要性，TYR基因也被列為與毛色性狀有關(guān)的重要研究基因之一。許多研究都表明，這3種基因的遺傳多態(tài)性與動(dòng)物的毛色性狀顯著相關(guān)。

研究一方面在貴州白水牛MC1R基因和TYR基因中篩選到突變位點(diǎn)，驗(yàn)證了敖啟燕等[12]對(duì)貴州水牛毛色研究的結(jié)果，同時(shí)擴(kuò)大了水牛品種分析的范圍，但發(fā)現(xiàn)這些SNPs位點(diǎn)在其他黑水牛品種中也存在，不具有特異性，因此不能解釋其特殊白色被毛形成的原因。接下來(lái)，筆者準(zhǔn)備擴(kuò)大群體分析這些突變位點(diǎn)在貴州白水牛和非白水牛品種之間的突變頻率是否有顯著差異，因?yàn)槊部赡苁嵌嗷蚩刂?。另一方面，毛色相關(guān)基因很多，本研究初步分析了3個(gè)毛色相關(guān)基因的突變情況，可以為下一步尋找其他可能的因果基因奠定基礎(chǔ)，試驗(yàn)結(jié)果豐富了我們對(duì)貴州白水牛毛色性狀遺傳機(jī)理的認(rèn)識(shí)，也為貴州白水牛的分子選育工作提供了一定的理論依據(jù)。