周艷　雷秋霞　韓海霞　李福偉　高金波　劉瑋　劉杰　曹頂國

摘要：為了檢測山東省地方雞種及其培育品系（種）中綠殼蛋基因的分布情況，本研究設(shè)計(jì)了多重PCR引物對(duì)部分山東地方雞種及綠殼蛋雞專門化品系進(jìn)行基因型鑒定。結(jié)果表明：汶上蘆花雞綠殼系公雞、母雞中的綠殼基因型頻率（ LS/LS）分別為0.9667和1.0000;某綠殼蛋雞專門化品系中綠殼基因純合型（LS/LS）個(gè)體比例只有7.69%，雜合型（LS/NN）比例高達(dá)92.31%;在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞中均未檢測到綠殼基因型。本檢測結(jié)果與各供試群體的遺傳背景相符，說明本檢測方法準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：綠殼蛋基因;分子檢測;山東地方雞種;綠殼系

Genotype Detection of Blue - Shelled Eggs in FiveShandong Local Chicken Breeds and Breeding Lines （ Species）Zhou Yan， Lei Qiuxia， Han Haixia， Li Fuwei， Gao Jingbo， Liu Wei， Liu Jie， Cao Dingguo

Abstract To investigate the distribution of blue - shelled gene in Shandong local chicken breeds andbreeding lines （species） ， multiplex PCR primers were set to detect the genotypes of some Shandong localchicken breeds and blue - shelled laying hens. The results showed that the frequencies of blue - shelled geno-type （ LS/LS） in roosters and hens of Wenshang barred chicken were 0.9667 and l.0000， respectively. Thefrequency of blue - shelled gene （ LS/LS） in the special blue - shelled strain was only 7. 69% ， but the heter-ozygous （ LS/NN） frequency was 92.31%. The blue - shelled genotype did not found in Langya chicken，Wenshang barred chicken and Luqin chicken. The results were consistent with the genetic background of thetested populations， which indicated that the method built in this research was accurate and fast.

Keywords Blue - shelled gene; Molecular detection; Shandong local chicken breeds; Blue - shelledstrain

雞蛋殼顏色是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，近年來，綠殼蛋因其顏色符合當(dāng)前人們追求健康的需求，因而受到廣泛歡迎。綠殼蛋雞是稀有雞種，我國只有東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、長順綠殼蛋雞等幾個(gè)地方雞種產(chǎn)綠殼蛋，而且產(chǎn)蛋量不高。為迎合市場需求，國內(nèi)育種企業(yè)通過與高產(chǎn)蛋雞雜交的方式培育綠殼蛋雞專門化品系進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于公雞和雜合型母雞均不能通過表型檢測其基因型，導(dǎo)致綠殼蛋雞純系的獲得較為困難，而常規(guī)的測交鑒定和純系選育等方式不但周期長，而且人力物力浪費(fèi)巨大。分子生物學(xué)的發(fā)展給家禽育種提供了更多途徑，通過分子標(biāo)記鑒定綠殼蛋基因型不但準(zhǔn)確率高、極大地節(jié)約成本，而且能加快育種進(jìn)程、推進(jìn)育種進(jìn)展。

Punnett[1]認(rèn)為雞蛋的綠殼性狀是1號(hào)染色體上顯性綠殼基因（OocVan，O）作用的結(jié)果。Bitgood等[2]將雞的綠殼基因（O）定位于1號(hào)染色體短臂上。Bartlett等[3]發(fā)現(xiàn)綠殼基因與內(nèi)源病毒因子（evl）及豆冠位點(diǎn)（P）連鎖。Bitgood等[4]進(jìn)一步驗(yàn)證了Bartlett等的結(jié)論，證明O-P的連鎖，并將其定位在GGA1的短臂上。王哲鵬等[5]研究表明雞綠殼蛋表型是由OATP基因大片段插入引起。Wang[6]和Wragg等[7]均進(jìn)一步揭示雞蛋綠殼性狀的分子機(jī)制是由有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽IB3基因（solute carier organic anion trans-porter familv member IB3，SLCOIB3，位于1號(hào)染色體65 319 441～65 338 450 bp）的5側(cè)翼區(qū)插入鳥類逆轉(zhuǎn)錄酶病毒（EAV - HP，長度約為4.2kb）所造成。當(dāng)EAV - HP插入到SLC01 83的5側(cè)翼區(qū)后，導(dǎo)致SLCOIB3基因在子宮部特異表達(dá)，從而使蛋殼顏色表現(xiàn)為綠殼。針對(duì)這一原理，本研究設(shè)計(jì)多重PCR引物對(duì)部分山東地方雞種及綠殼蛋雞專門化品系進(jìn)行綠殼蛋基因型鑒定，以期為山東地方雞種創(chuàng)新利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞均取自山東省地方雞品種資源活體基因庫，汶上蘆花雞綠殼系取自山東龍盛農(nóng)牧集團(tuán)，某綠殼蛋雞專門化品系來自山東省某育種企業(yè)。238只待測個(gè)體均為隨機(jī)取樣，翅下靜脈采血約l mL，ACD抗凝，常規(guī)酚/氯仿提取基因組DNA，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

2×Taq PCR MasterMix、Marker I購自天根生化科技（北京）有限公司，瓊脂糖、蛋白酶K、Tris飽和酚以及常規(guī)耗材購自濟(jì)南金博生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的SLCOIB3（GeneBank accessionnumber：JN020139.1）和EAV - HP（GenBank ac-cession number： JF837512）序列，設(shè)計(jì)1條上游引物F和2條下游引物R1和R2（F：5'-TGAC-CAGCGTAGATAAACAT-3; R1：5- TCAGAAAGACCCATAGAAAT-3 ;R2：5 '-AACACGTAGCCTAT-AGCAA T-3），擴(kuò)增片段長度為223 bp和397 bp。

1.4 待測個(gè)體基因型檢測

多重PCR擴(kuò)增體系（25μL）：2×Taq PCRMasterMix 12.5μL、ddH2O 8.5μL、F引物（10pmol/μL）1.OμL， R1引物（10 pmol/μL）1.0μL，R2引物（10 pmol/μL）1OμL，模板DNA（50ng/μL）1.0μL。

PCR擴(kuò)增程序：95℃ 3 min;95℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 20 s，共36個(gè)循環(huán);72℃5 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物檢測：120V、1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存用于后續(xù)基因型判定。

1.5 基因型判定

PCR產(chǎn)物只檢出片段長度為397 bp的單一目的條帶，表明該個(gè)體基因型為NN/NN（非綠殼純合型）;PCR產(chǎn)物只擴(kuò)增出片段長度為223 bp的單一目的條帶，表明該個(gè)體基因型為LS/LS（綠殼純合型）;PCR產(chǎn)物擴(kuò)增出223 bp和397 bp兩條目的條帶，表明該個(gè)體基因型為LS/NN（綠殼雜合型）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR檢測結(jié)果

由圖1可知，該引物組合擴(kuò)增出的目的片段符合預(yù)期，且條帶單一，邊緣清楚，無非特異條帶干擾，雜合子中的兩條帶能夠清楚分離。分別選取綠殼純合型（ LS/LS）和非綠殼純合型（NN/NN）各2個(gè)純合個(gè)體送濟(jì)南力戈科技有限公司測

2.2 供試群體綠殼基因型檢測結(jié)果

由表2可知，汶上蘆花雞綠殼系公雞30個(gè)個(gè)體中有29個(gè)為綠殼純合型，占96.67%，綠殼等位基因LS頻率為0.9833;28個(gè)母雞個(gè)體均為綠殼純合型，綠殼等位基因LS頻率為1.0000。某綠殼蛋雞專門化品系13個(gè)母雞個(gè)體中綠殼純合型只有1個(gè)，綠殼基因雜合型比例達(dá)92.31%。在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞的公、母雞中均未檢測到綠殼基因型，非綠殼純合型比例為100%。

3 討論與結(jié)論

選用的5個(gè)供試群體中，包含2個(gè)山東地方雞種、2個(gè)專門化品系和1個(gè)培育品種，共238個(gè)待檢個(gè)體的基因型判定結(jié)果符合預(yù)期，其中在瑯琊雞、汶上蘆花雞和魯禽雞中均未發(fā)現(xiàn)有綠殼蛋基因型，汶上蘆花雞綠殼系中的綠殼蛋基因純合型比例較高，在58個(gè)供試個(gè)體中僅檢出1例雜合序，BioEdit軟件比對(duì)結(jié)果表明測序結(jié)果與原設(shè)計(jì)序列相符?；蛐汀６尘G殼蛋雞專門化品系中雜合型比例高達(dá)92.31%，因此在后續(xù)選育過程中需要加大提純力度。檢測結(jié)果表明設(shè)計(jì)的多重PCR引物組合適應(yīng)性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高，無論在地方雞種、專門化品系還是培育品種中均能準(zhǔn)確區(qū)分、鑒定綠殼蛋純合型、雜合型以及非綠殼蛋純合型個(gè)體。

雖然分子生物學(xué)手段大大提高了綠殼蛋基因選擇的準(zhǔn)確率、縮短選擇時(shí)間、加快育種進(jìn)程[8]，但綠殼性狀是由多基因控制的表型性狀[9]，單一分子標(biāo)記不能完全解決這一問題。為了充分挖掘利用這些為數(shù)不多的寶貴遺傳資源[10]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)該繼續(xù)研究其分子機(jī)理，全面揭示其遺傳機(jī)制，以期將這一重要經(jīng)濟(jì)性狀更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。

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