許小潔　于偉鵬　楊廣玲　韓士玲　何夢君　楊旭　李向東

摘要：利用RT- PCR克隆甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV） DWKI分離物輔助成分一蛋白酶（ helper component - proteinase，HC - Pro）基因，酶切后連接原核表達(dá)載體pEHISTEV，得到重組質(zhì)粒pE-HISTEV - SCMV - HC - Pro。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出57 kD的融合蛋白。切膠回收融合蛋白，多點(diǎn)注射法免疫新西蘭長耳兔，制備SCMV HC - Pro抗血清。間接ELISA結(jié)果表明，該血清效價為1：8 192。感染DWKI的玉米葉片病汁液稀釋128倍時，該血清仍然能夠有效檢測出HC - Pro。Westem - blot檢測結(jié)果表明，該血清可特異性檢測SCMV第1組分離物DWKI和第Ⅳ組分離物DWK2，與同屬的煙草脈帶花葉病毒（ TVBMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）均無反應(yīng)。本研究為準(zhǔn)確、快速檢測SCMV HC -Pro并進(jìn)一步研究其功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗花葉病毒;輔助成分一蛋白酶;原核表達(dá);抗血清;檢測

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of HelperComponent - Proteinase of Sugarcane mosaic virusXu Xiaojie1，2 ， Yu Weipengl，2* ， Yang Guanglingl ， Han Shilingl ， He Mengjunl ， Yang Xul ， Li Xiangdong"2

Abstract

The helper component - proteinase （HC-Pro） gene of Sugarcane mosaic ViruS （SCMV） iso-late DWKl was cloned by RT-PCR， and ligated to prokaryotic expression vector pEHISTEV after enzymaticdigestion， producing the recombinant plasmid pEHISTEV-SCMV-HC-Pro. The recombinant plasmid wastransformed into Escherichia coli strain Rosetta， and expressed a fusion protein of 57 kD after induction withIPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immumze the New Zealand long - earedwhite rabbits to produce polyclonal antiserum against SCMV HC - Pro. Titer of the antiserum was l：8192 whendetermined by indirect ELISA. SCMV HC-Pro could be detected even the extracts of DWKl-infected cornleaves were diluted at 128 times. Western-blot analysis showed that the antiserum could detect HC-Pro of i-solates DWKl （SCMV group I） and DWK2 （SCMV group IV） ， but had no cross reaction to that of Tobaccovein mosaic VLrUS and Potato virus Y belonging to the Potyvirus. This study provided solid foundation for thequick and precise detection of SCMV HC - Pro and will facilitate the study on function and mechanism of SC-MV HC-Pro.

Keywords Sugarcane mosaic ViuS; Helper component - proteinase; Prokaryotic expression; Antise-rum; Detection

玉米矮花葉病是威脅我國東北、華北、西南山區(qū)三大玉米產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，其發(fā)生面積廣、危害重、經(jīng)濟(jì)損失大，已成為限制我國玉米糧食作物生產(chǎn)的重要因素。據(jù)農(nóng)業(yè)部全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心“玉米病毒病治理對策研討會”會議紀(jì)要報道，1996年玉米矮花葉病發(fā)病面積達(dá)2.33×106公頃，毀種絕產(chǎn)4×104公頃，產(chǎn)量損失5億千克。

引起玉米矮花葉病的毒原有多種，其中甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic Virus，SCMV）是引起我國玉米矮花葉病的主要病毒[1，2]。SCMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Pot-yvirus），可以經(jīng)蚜蟲和種子傳播。SCMV粒體為線狀，基因組為正單鏈RNA，長約9600核苷酸，編碼11個成熟蛋白[3]。其中輔助成分一蛋白酶為多功能蛋白，參與病毒蚜傳、復(fù)制、移動等過程，具有RNA沉默抑制活性[4-6]。

根據(jù)全基因組序列比對結(jié)果，SCMV分為5組，其中以BD8、DWK2為代表的第Ⅳ組致病力強(qiáng)，在生產(chǎn)中的危害越來越大[7，8]。本研究目的是制備可以檢測SCMV第1組和第Ⅳ組分離物HC-Pro、但與馬鈴薯Y病毒屬其它病毒HC -Pro沒有反應(yīng)的抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

感染SCMV第1組分離物DWKI和第Ⅳ組分離物DWK2的玉米樣品均采自山東省泰安市岱岳區(qū)大汶口鎮(zhèn)（ N350 57'14. 05”，E1170 04'58. 66"）[9];原核表達(dá)載體pEHISTEV、大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株Rosetta（ DE3）由英國安德魯斯大學(xué)劉煥庭老師惠贈;大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

Phusion DNA聚合酶、Western blot所用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司;植物總RNA提取試劑盒TransZol、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒為TransGen公司產(chǎn)品;限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa公司;硝酸纖維素膜（NC）為Pall Gelman公司產(chǎn)品;羊抗兔IgG（堿性磷酸酯酶標(biāo)記）、鼠抗兔IgG（辣根過氧化物酶標(biāo)記）、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑購自Sigma公司;IPTG、DTT、甲醇等其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)SCMV - DWK1序列（登錄號KU171814）設(shè)計克隆SCMV - HC - Pro基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。SCMV -HC - Pro基因克隆正向引物為SCMVHC一Pro -F：5- CGGGATCCGCTGATCCACAAGCGAATAG -3（下劃線部分為BamH I酶切位點(diǎn)）;反向引物為SCMVHC—Pro- R：5- GGAGCTCTTATCCCAC-TATATATTCACGCATCTC -3（下劃線部分為Sac I酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段長度約為1380 bp。

1.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

參照TransZol試劑盒使用說明，提取DWK1玉米樣品總RNA，以RNA為模板，選擇隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用引物SCMVHC—pro。一F、SCMVHC—Pro-R擴(kuò)增SCMV - HC - Pro基因。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃30 s;98℃ 10 s，65℃ 20 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min，18℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，紫外燈下切取目的條帶，經(jīng)PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒回收純化后，用BamH I、Sac I進(jìn)行雙酶切，與相同酶切處理的pEHISTEV載體通過T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。采用PCR、酶切驗(yàn)證篩選陽性克隆，由濟(jì)南博尚生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證。

將測序驗(yàn)證后的陽性克隆提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta菌株。挑取單菌落用3 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)12 h后，取1mL菌液加入150 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2.5～3 h，使OD600，值達(dá)0.4～0.6。將菌液分為兩份，一份加入終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG，于28℃、150 r/min誘導(dǎo)Sh;另一份加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于28qC、150 r/min分別誘導(dǎo)0、l、2、3、4、5、6h。4qC、12000 r/min離心10 min收集菌體，加適量TE緩沖液（pH8.0）振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，冰上放置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取10μL上清進(jìn)行SDS - PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況，并利用軟件BandScan 5.0分析融合蛋白HC - Pro表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的百分比。

1.4 抗血清制備、效價及特異性測定

原核表達(dá)的目的蛋白電泳后，用4 0C預(yù)冷的含0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT的顯色液進(jìn)行染色，切取目的蛋白條帶于預(yù)冷的研缽中，按1：1（W/V）加入0.9%生理鹽水充分研磨。初次免疫目的蛋白需加入等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，采取皮下多點(diǎn)注射新西蘭長耳兔，一周后改用弗氏不完全佐劑進(jìn)行蛋白乳化，以后每隔一周注射一次，共5次，最后一次免疫一周進(jìn)行心臟取血，分離血清后，于-20℃長期保存。

利用間接ELISA法測定抗血清效價：將DWK1玉米樣品按1：10（ W/V）的比例加入抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）充分研磨后，加入酶聯(lián)板中，以相同的方法處理健康玉米葉片作為陰性對照。按照1：26～1：214對抗血清進(jìn)行梯度稀釋。顯色后使用酶標(biāo)儀讀取OD405值，以I（待測樣品讀數(shù)一空白讀數(shù)）/H（陰性樣品讀數(shù)一空白讀數(shù)）≥2.0作為陽性反應(yīng)[10]。

參照Towbin等[Il]的方法進(jìn)行Western -blot，分析抗血清的特異性和靈敏度：以DWK1、DWK2玉米樣品和分別感染煙草脈帶花葉病毒、馬鈴薯Y病毒的普通煙以及pEHISTEV - SCMV -HC - Pro的原核表達(dá)產(chǎn)物為檢測對象，以健康玉米葉片、普通煙葉片、pEHISTEV空載體的原核表達(dá)產(chǎn)物為陰性對照，測試抗血清的特異性;將DWKI玉米樣品病汁液按照1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512稀釋，以健康玉米葉片作為陰性對照，進(jìn)行Western - blot分析。蛋白經(jīng)SDS - PAGE電泳后于4qC轉(zhuǎn)至NC膜，再用5%脫脂奶粉溶液將NC膜4qC封閉過夜。第二天，按1：500將制備的抗血清加入封閉液中，孵育、洗滌后加入HRP -鼠抗兔IgG稀釋液中（1：50 000稀釋）。將HRP - ECL化學(xué)發(fā)光所用A、B發(fā)光液按1：1混合，覆于NC膜上，用ChampChemi全自動化學(xué)發(fā)光儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCMV - HC - Pro基因克隆及原核表達(dá)

通過RT - PCR從DWK1玉米樣品中均克隆到1380 bp左右的特異性DNA條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。經(jīng)BamH I、Sac I進(jìn)行雙酶切后連接到pEHISTEV載體，得到重組質(zhì)粒pEHISTEV -SCMV - HC - Pro。

將重組質(zhì)粒pEHISTEV - SCMV - HC - Pro轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta菌株，菌液經(jīng)IPTG不同濃度和時間誘導(dǎo)，以pEHISTEV空載體原核表達(dá)產(chǎn)物為陰性對照，通過SDS - PAGE電泳檢測目的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在57 kD左右出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶（圖2、3），與預(yù)期結(jié)果一致，說明目的蛋白在E.coli Rosetta菌株中已成功表達(dá)。在IPTG濃度梯度中，當(dāng)其濃度為0.2 mmol/L時蛋白即可表達(dá)，融合蛋白HC - Pro表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的32.5%;增加IPTG濃度，對HC-Pro表達(dá)量無顯著影響（圖2）。WTG誘導(dǎo)1 h時融合蛋白即可表達(dá)，表達(dá)量約占細(xì)菌總蛋白的9.7%;隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達(dá)量增加;在誘導(dǎo)Sh時，融合蛋白HC -Pro表達(dá)量達(dá)到最大，占細(xì)菌總蛋白的32.8%;延長誘導(dǎo)時間，對表達(dá)量無顯著影響（圖3）。

2.2 抗血清制備及效價測定

原核表達(dá)的HC-Pro經(jīng)SDS-PAGE分離后乳化，采取皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭長耳兔，注射5次后獲得SCMV HC-Pro抗血清。以DWK1玉米樣品為試驗(yàn)材料進(jìn)行效價測定，以健康的玉米葉片為陰性對照，利用間接ELISA法測得抗血清效價（表1），抗體在被稀釋到8192倍時仍呈現(xiàn)明顯的陽性，表明抗體具有較高的效價。

2.3 抗血清特異性檢測

利用Western - blot分析抗血清特異性及靈敏度。結(jié)果顯示，SCMV HC-Pro抗血清可同時對DWK1、DWK2玉米樣品進(jìn)行檢測;制備的抗血清與馬鈴薯Y病毒屬的煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯Y病毒樣品均無反應(yīng)（圖4）。在對pE-HISTEV-SCMV-HC-Pro原核表達(dá)產(chǎn)物檢測時，由于原核表達(dá)的SCMV-HC-Pro基因攜帶His標(biāo)簽，所以其大小較野生型病毒大，符合預(yù)期結(jié)果（圖4）。將DWK1樣品病汁液稀釋128倍時，利用制備的抗血清仍然能夠檢測到病毒（圖5）。綜上結(jié)果，本研究制備的抗血清具有較高的特異性及靈敏度。

3 討論與結(jié)論

梁新苗等[12]利用原核表達(dá)載體pET22b（+）表達(dá)了SCMV北京分離物的HC-Pro基因，用原核表達(dá)產(chǎn)物制備的抗血清可用于檢測SCMV北京分離物的HC-Pro;以發(fā)病玉米汁液為抗原，效價可達(dá)1：4096。本研究利用原核表達(dá)載體pE-HISTEV表達(dá)了SCMV第1組分離物DWK1的HC-Pro基因，表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的32.5%。利用大腸桿菌Rosetta（DE3）表達(dá)的HC-Pro蛋白制備抗血清，效價為1：8192。該血清可檢測SCMV第1組分離物DWK1和第Ⅳ組分離物DWK2的HC - Pro;當(dāng)感染DWKI的玉米植株病汁液稀釋到128倍時，該抗血清仍能對SCMVHC-Pro進(jìn)行檢測，且該抗體與同為馬鈴薯Y病毒屬的煙草脈帶花葉病毒、馬鈴薯Y病毒樣品均無反應(yīng)。

少數(shù)情況下，通過SDS凝膠電泳分離蛋白制備的抗體可能無法對未變性蛋白進(jìn)行檢測。這可能是由于蛋白變性、空間構(gòu)象被破壞導(dǎo)致抗原決定簇發(fā)生改變，抗原與抗體無法特異性識別[13]。本研究制備的抗體可用于對SCMV HC-Pro進(jìn)行ELISA和Western Blot檢測。

本研究制備的抗血清具有較高的特異性、靈敏度，為SCMV HC-Pro檢測、功能和作用機(jī)理研究提供了重要的物質(zhì)保證。

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