呂冬偉　劉歡　田鵬華　徐榕雪

摘要：將定量孔石莼藻體添加到模擬養(yǎng)殖廢水中，研究孔石莼在不同營養(yǎng)鹽濃度梯度下，對水體中氮、磷營養(yǎng)鹽的吸收情況。結(jié)果表明，孔石莼對濃度越高的氮磷營養(yǎng)鹽吸收率越快，但去除率越低;對銨態(tài)氮和磷酸鹽的吸收效果明顯，對硝態(tài)氮有所吸收，而對亞硝態(tài)氮的吸收不明顯;對銨態(tài)氮吸收曲線分3個階段分析后發(fā)現(xiàn)，其第一階段符合一級動力學(xué)方程，第二階段的吸收符合線性方程。這說明孔石莼在不同濃度營養(yǎng)鹽養(yǎng)殖廢水中均具有很好的水體凈化作用，對防治水體富營養(yǎng)化有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：孔石莼;養(yǎng)殖廢水;銨態(tài)氮;硝態(tài)氮;亞硝態(tài)氮;磷酸鹽;氮磷吸收比值

Study on Absorption of Different Forms of Nitrogen andPhosphate by Macroalgae Ulva pertusa in SeawaterLu Dongwei， Liu Huan， Tian Penghua， Xu Rongxue

Abstract The nitrogen and phosphate absorption of Ulva pertusa cultivated in the simulated piscatorialwastewater with different nutrient concentrations were studied in this paper. The experiment results showed thatthe higher the nitrogen and phosphate concentrations were ， the higher the uptake rates and the lower removalrates of Ulva pertu.sa were. The absorption effect of ammonia nitrogen and phosphate were obvious， and part ofnitrates nitrogen was absorbed， but the absorption of nitrite was not obvious. After dividing the ammonia nitro-gen absorption curve into three stages， it was found that the first stage curve accords with the first - order ki-netic equation and the second stage curve yielded a linear equation. The results showed that Ulva pertusa hadbetter effect on water purification， and showed better application prospect in preventing the eutrophication ofwater bodies.

Keywords

Ulva pertusa; Piscatorial wastewater; Ammonia nitrogen; Nitrate nitrogen; Nitrite nitrogen;Phosphate; N/P absorption ratio

孔石莼（Ulva pertusa）屬于綠藻門石莼屬，廣泛分布于西太平洋沿海，藻體鮮艷，味道鮮美，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，并且生長快、質(zhì)地薄可食用，還具有生物學(xué)和藥用價值。近年來，對于孔石莼的開發(fā)利用引起了國內(nèi)外的關(guān)注。

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模化增加，高密度、高產(chǎn)量的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖逐漸成為未來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要方向[1，2]，如何處理養(yǎng)殖廢水漸漸引起人們的注意，如何高效和低成本地凈化養(yǎng)殖水體是現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖工程的重要組成部分。國內(nèi)外學(xué)者一致認為混養(yǎng)大型藻類是吸收、利用營養(yǎng)物質(zhì)和延緩水質(zhì)富營養(yǎng)化的有效措施之一[3，4]。國外已經(jīng)有利用大型海藻吸收水中營養(yǎng)鹽凈化廢水的報道[5]，國內(nèi)近幾年來也有一些利用大型海藻凈化體系凈化養(yǎng)殖水體、修復(fù)生態(tài)環(huán)境的報道[6-10]。石莼屬大型海藻，能夠快速利用營養(yǎng)物質(zhì)從而延緩水體富營養(yǎng)化，是國內(nèi)外學(xué)者的共識，其在大型海藻凈化體系中的重要性得到多次驗證[11-13]。但是孔石莼對不同濃度營養(yǎng)鹽的吸收研究國內(nèi)外尚少見報道。本試驗通過研究孔石莼對模擬養(yǎng)殖廢水中不同濃度營養(yǎng)鹽的吸收狀況以及幾種營養(yǎng)鹽的相互作用，探討利用孔石莼處理養(yǎng)殖廢水的可行性、高效性，以期為在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中建立大型海藻凈化體系提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料來源與培養(yǎng)條件

孔石莼與海水均取自山東煙臺養(yǎng)馬島海域?？资唤?jīng)室內(nèi)（20±2）℃條件下馴化培養(yǎng)3天后，選取生長良好的孔石莼藻體進行試驗。海水營養(yǎng)鹽濃度分別為：銨態(tài)氮0.059 mg/L、硝態(tài)氮0.012mg/L、亞硝態(tài)氮0.073mg/L、磷酸鹽0.067mg/L，經(jīng)砂濾和消毒后抽取使用。

取5只相同規(guī)格（5L）錐形瓶，加入經(jīng)過砂濾和消毒的海水，分別添加氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀，使瓶中各營養(yǎng)鹽濃度依次分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L。由于海水中營養(yǎng)鹽濃度很低，對試驗結(jié)果所造成的影響可忽略不計。5個瓶中分別放人甩干的孔石莼，使海水中的生物量為4.0g/L，放于實驗室中培養(yǎng)，溫度為（20±2）℃，光照強度為3000 lx，光/暗周期為14h/10 h。根據(jù)設(shè)定時間取樣，分析孔石莼對4種不同濃度梯度營養(yǎng)鹽的吸收情況。同時設(shè)置5個營養(yǎng)鹽濃度梯度海水不添加孔石莼藻體培養(yǎng)，作為空白對照。

1.2 測定項目及方法

銨態(tài)氮采用次溴酸鹽氧化法測定;亞硝態(tài)氮采用磺胺乙二胺分光光度法測定;硝態(tài)氮采用鎘柱還原法測定;磷酸鹽采用磷鉬藍分光光度法測定。式中：A（ N03-）為兩次測定的硝態(tài)氮吸光值平均值;Ai，（ N03-）為兩次測定的空白平均值;A（ NOl-）為兩次測定的亞硝態(tài)氮吸光值平均值;Ai，（ N02-）為兩次測定的空白平均值。

當R小于95%時，還原柱需重新進行活化或重新裝柱。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、總磷在水體中的含量具體測定方法采用《海洋監(jiān)測規(guī)范》（GB 17378.5-2007）[14]中的標準方法進行。

1.3 曲線回歸分析

吸收曲線的回歸分析采用軟件OriginPr0 8.0分析處理。

吸收速率計算公式：

v=（Cl - C2）×V/[（T2 - Ti）xM] .式中：v為吸收率，mg/（g·h）;V為海水體積，L;Cl、C2分別為T1、T2時刻的氮磷濃度，mg/L;M為生物量（鮮重），g。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔石莼對營養(yǎng)鹽的吸收與濃度的關(guān)系

2.1.1 孔石莼對銨態(tài)氮的吸收 5個濃度梯度的空白對照，銨態(tài)氮含量在試驗周期內(nèi)無顯著性差異（P>0.05），因此由非孔石莼吸收造成的銨態(tài)氮濃度變化可以忽略不計。由圖1可以看出，孔石莼對海水中濃度為1.0 mg/L的銨態(tài)氮吸收較徹底，第6天即近完全吸收，之后保持不變。與顧宏等[9]的研究結(jié)果相似。除此之外，孔石莼對其它4個濃度的銨態(tài)氮也有較好的吸收。隨著銨態(tài)氮濃度的升高，吸收量增大，于第6天基本達到吸收平衡，之后濃度波動不大?？资粚?.0～5.0mg/L銨態(tài)氮前6天的平均吸收率分別為：0. 009、0.016、0.021、0.027、0.036mg/（g.h）.隨著銨態(tài)氮加富濃度的提高，吸收率隨之提高。

有研究表明，孔石莼對初始濃度為1.0 mg/L的NH4+的吸收分為3個階段[9，10]。本研究中，孔石莼對5個濃度梯度銨態(tài)氮的吸收不能簡單地用一級生化反應(yīng)曲線來描述其整個過程，也應(yīng)分為3個階段：第一階段快速吸收階段（Vs），此階段孔石莼處于“氮饑餓”狀態(tài)，吸收NH4+的速率最快，是充盈細胞內(nèi)營養(yǎng)庫的階段[13];第二階段內(nèi)部控制的吸收階段（Vi），此階段吸收趨于平穩(wěn)，可能是充盈的細胞內(nèi)氮庫的反饋抑制作用[14];第三階段外部控制的吸收階段（Ve），是由介質(zhì)營養(yǎng)鹽濃度控制吸收[4]，即隨著介質(zhì)營養(yǎng)鹽的消耗，吸收速率迅速下降而引起的，逐漸趨于零。依照Vi階段快速平穩(wěn)的特性來區(qū)分這3個階段，可看出Vs階段對于NH4+初始濃度為1.0 mg/L與2.0mg/L是0～1天，3.0 mg/L與5.0 mg/L為0～4天，4.0 mg/L為0～3天。對于Vi和Ve階段的區(qū)分是當NH4+初始濃度為1.0 mg/L和4.0 mg/L時在第5天比較明顯，當NH4+初始濃度為2.0mg/L和5.0 mg/L時在第6天明顯，NH4+初始濃度為3.0 mg/L未出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)折。

對圖中各濃度的前兩個階段進行分段曲線擬合，Vs階段孔石莼對銨態(tài)氮的吸收基本符合一級生化反應(yīng)動力學(xué)方程，Vi階段孔石莼對銨態(tài)氮的吸收基本呈線性關(guān)系。NH4+初始濃度為5.0mg/L時，可能由于孔石莼吸收NH4+的速率小于細胞充盈氮庫的速率，從而導(dǎo)致圖像中Vs階段中0.5～1天孔石莼對NH4+的吸收不能很好地符合一級生化反應(yīng)動力學(xué)方程;銨態(tài)氮濃度為4.0mg/L與5.0 mg/L時Vi所包含的點較少。因而不對上述兩個階段進行擬合，結(jié)果見表1。

Vs階段中孔石莼對1.0～5.0 mg/L的培養(yǎng)液中的銨態(tài)氮，每瓶吸收量分別為0.62、0.98、1. 85、2.26、3.36 mg，其差距很明顯?？资坏獛斓拇笮〔⒉皇枪潭ǖ?，其大小隨銨態(tài)氮濃度的提高而變大。Vs階段的分析結(jié)果與李秀辰等[15]論述的理論模型中自然對數(shù)e的指數(shù)方程大致相同但有些差異，主要原因可能在于光照強度、環(huán)境溫度和孔石莼生物量對孔石莼吸收銨態(tài)氮均有較明顯的影響。

2. 1.2 孔石莼對硝態(tài)氮的吸收從圖2可以看出，孔石莼對硝態(tài)氮的吸收不如銨態(tài)氮，而且隨著硝態(tài)氮濃度的升高，達到吸收穩(wěn)定的時間逐漸縮短。初始濃度為1.0～4.0 mg/L時，3天后的濃度變化不大，而在初始濃度為5.0 mg/L時，培養(yǎng)后期濃度有波動。這可能是由于孑L石莼在高濃度硝態(tài)氮存在時的快速過量吸收，隨后組織細胞又向介質(zhì)釋放有關(guān)。Brinkhuis等[16]同樣觀察到海帶對硝態(tài)氮起始階段快速吸收隨后吸收率迅速下降的現(xiàn)象，主要原因為組織向介質(zhì)釋放硝態(tài)氮。

2.1.3 孔石莼對亞硝態(tài)氮的吸收 由圖3可以看出，孔石莼在l～2天內(nèi)對亞硝態(tài)氮有少量吸收，之后亞硝態(tài)氮濃度基本保持不變。三種形式的氮鹽同時存在時，孔石莼對氮鹽的吸收是有選擇性的，對亞硝態(tài)氮的親和性最低。

2.1.4 孔石莼對磷酸鹽的吸收從圖4中可以看出，在2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L磷酸鹽吸收曲線中，其圖像大體可以分為3個階段。第一階段，第1天的吸收速率比較低;第二階段，2～3天內(nèi)吸收速率升高;第三階段，吸收速率逐漸降低而接近于零。第一階段吸收速率較第二階段低可能是因為較高濃度的硝態(tài)氮與磷搶占傳遞受體，抑制對磷酸鹽的吸收。在第1～2天之后硝態(tài)氮的濃度大幅下降，孔石莼對溶液中磷酸鹽的吸收速率上升。與上述4個濃度磷酸鹽吸收情況不同的是，1.0mg/L磷酸鹽第1天即出現(xiàn)快速吸收，這與體系中氮鹽含量低有關(guān)。

2.2 孔石莼對營養(yǎng)鹽的去除效果與濃度的關(guān)系

孔石莼對銨態(tài)氮的吸收迅速，銨態(tài)氮濃度為1.0～5.0 mg/L時吸收率分別為0.2083、0.2764、0.3806、0.5696、0.8521 mg/（g·h），隨著銨態(tài)氮濃度的升高孔石莼對銨態(tài)氮的吸收率也逐漸提高?？资粚喯鯌B(tài)氮的吸收很慢，亞硝氮濃度為1.0～5.0 mg/L時吸收率分別0.00304、0. 00217、0.00243、0.00382、0.00503 mg/（g.h）.硝態(tài)氮和磷酸鹽的濃度為1.0～5.0 mg/L時，對硝態(tài)氮吸收率分別為0. 00859、0.01146、0. 01606、0.01858、0.01901 mg/（g.h）;對磷酸鹽吸收率分別為0.0375、0.0167、0.0149、0.0135、0. 0104 mg/（g·h）。

由圖5可知，孔石莼對銨態(tài)氮去除效果非常好，初始濃度為1.0～5.0 mg/L時，前6天的去除率均超過80%;對硝態(tài)氮的去除效果較好，濃度為1.0～5.0 mg/L時去除率分別為99.0%、66.0%、61.7%、53.5%、43.8%;對亞硝態(tài)氮的去除效果稍差，濃度為1.0～5.0 mg/L時去除率分別為35.0%、12.5%、9.3%、11.0%、11.6%。水樣氮鹽初始濃度越低，孔石莼對其去除效果越好，即生物量與初始營養(yǎng)鹽濃度比越大越好。比較孔石莼對銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮及硝態(tài)氮的吸收情況發(fā)現(xiàn)，孔石莼對硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮去除率遠低于對銨態(tài)氮的去除率。原因在于，一是孑L石莼吸收銨態(tài)氮后，可以直接將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為可被直接利用的谷氨酸鹽[16]，而硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮必須先被轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮或低價態(tài)氨鹽才能被藻體吸收利用;二是硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，熱源主要來自室內(nèi)光源和室溫，因此在夜間硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮吸收量極少而氨態(tài)氮在夜間有一定量的吸收。本研究中在銨態(tài)氮濃度很高時，孔石莼對硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮依然有一定量吸收，這一點與羊棲菜和海帶相似[17]。

磷酸鹽在初始濃度為1.0～5.0 mg/L時，6天內(nèi)孔石莼對其去除率分別為83.0%、65.5%、46.3%、47.5%、24.0%?？资粚α姿猁}的總體吸收情況是：初始濃度較低時，吸收效果最好，隨著初始濃度的升高，達到吸收穩(wěn)定的時間越來越短，吸收效果也越來越差。產(chǎn)生以上情況的原因，其一在于孔石莼對磷酸鹽的吸收隨著氮濃度的升高而變得不明顯，即磷的吸收與氮的吸收有相互作用;其次在于初始磷酸鹽濃度較低時，銨態(tài)氮的初始濃度也很低，銨態(tài)氮吸收很快，氮相對殘留少，磷的吸收效果好，隨著濃度升高，氮的濃度升高，殘留氮（主要是硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮）相對逐漸升高;其三在于磷的吸收是主動吸收，因此孔石莼對磷酸鹽的吸收還與溫度及細胞內(nèi)磷酸鹽濃度有關(guān);最后，在試驗中孔石莼的生物量是固定的，影響了其吸收效果。

2.3 N/P吸收比值與濃度的關(guān)系

孔石莼對總?cè)芙鉄o機氮（ NH4+ -N、N03- -N、NO2- -N）與溶解無機磷（PO43-P）的吸收比值在6天的培養(yǎng)時間內(nèi)變化幅度為4.3～23.0（圖6）。盡管各濃度梯度的初始海水中N/P值都是6.0，但是孔石莼在不同濃度下，對N/P的吸收比值是不同的。孔石莼對N/P的吸收比值隨著無機氮和無機磷濃度的增加而增加。濃度為5.0mg/L時培養(yǎng)第1天吸收比值最高，達23.0。濃度為1.0 mg/L時，6天的培養(yǎng)期間內(nèi)，N/P吸收比值變化不顯著（P>0.05），平均值為5.1。低N/P吸收比值說明本試驗中低營養(yǎng)鹽海水處于N限制?？资辉诟叩诐舛认碌腘/P吸收比值高于低氮磷濃度，表明孔石莼對氮、磷的吸收比值是隨著環(huán)境中營養(yǎng)鹽濃度的變化而變化的。Liu等[18]曾發(fā)現(xiàn)三種大型海藻剛毛藻（Cladophorasp.）、克里藻（Klebsormidium sp.）和假魚腥藻（Pseudanabaena sp.）吸收N/P比值隨著初始氮、磷濃度的不同而變化?？资辉诘谝惶鞂Φ绕涫卿@態(tài)氮的吸收對于提高N/P吸收比值有重要影響。Pedersen發(fā)現(xiàn)野生大型海藻石莼（Ulva lac-tuca）在放入高濃度銨態(tài)氮海水中的初始15 min內(nèi)，對銨態(tài)氮的吸收比需求的N高出20倍[18]。培養(yǎng)1天后，高濃度營養(yǎng)鹽海水中N/P的吸收比值迅速降低，這主要是因為海水中銨態(tài)氮濃度經(jīng)過1天的吸收已迅速降低，孔石莼對氮的吸收減慢，對磷的吸收加快（圖1～圖4）。

3 討論與結(jié)論

孔石莼對銨態(tài)氮的去除效果很好，吸收主要階段是快速吸收階段（Vs），這階段銨態(tài)氮的吸收符合一級動力學(xué)方程，隨后的第二階段符合直線方程。孔石莼氮庫的大小并不是恒定的，其大小隨外界銨態(tài)氮濃度增大而變大?？资粚喯鯌B(tài)氮和硝態(tài)氮的吸收效果遠不如銨態(tài)氮，而且隨著硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度的升高，達到吸收穩(wěn)定的時間逐漸縮短。當銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮同時存在且含量相當時，孔石莼優(yōu)先吸收銨態(tài)氮。孔石莼對磷酸鹽吸收效果總體來說較明顯。但孔石莼對磷酸鹽的吸收隨著氮濃度的升高而降低。孔石莼對N/P的吸收比值是可變的，隨著水環(huán)境中營養(yǎng)鹽的濃度變化而變化。本試驗表明孔石莼對水體中營養(yǎng)鹽特別是銨態(tài)氮有快速和高效的去除作用，理論上可以應(yīng)用于循環(huán)養(yǎng)殖廢水處理系統(tǒng)。

參考文獻：

[1] 范薇，周景成，馬躍，等.海參工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)[J]。漁業(yè)現(xiàn)代化，2006（5）：15 -16.

[2]李連春，梁日東，張廣海，等.中國淡水工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2011（7）：4-5.

[3]Zhou Y， Yang H. Hu H. et al.Bioremediation potential of themacroalga Gracilaria lemaneiformi.s（ Rhodophyta） integrated in-to fed fish culture in coastal waters of north China[J].Aqua-culture， 2006， 252： 264 - 276.

[4] Skriptsova A V， Miroshnikova N V.Laboratory experiment todetermine the potential of two macroalgae from the RussianFar - East asbiofilters for integrated multi - trophic aquaculture（IMTA） [J]. BioresourCe Technology， 2011， 102： 31493154.

[5]Luo M B，Liu F，Xu Z L.Growth and nutrient uptake capacityof two co - occurring species，Uha prolifera and Ulva linza[J]. Aquatic Botany. 2012. 100： 18 24.

[6] 譚海麗.無居民海島潮間帶大型海藻生態(tài)修復(fù)研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2012.

[7] 徐惠君，黃文怡，王菲，等.洞頭海區(qū)大型海藻養(yǎng)殖凈化海水水質(zhì)的研究[J].生物學(xué)通報，2011，46（3）：49 -50.

[8] 葛長字.大型海藻在海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生物凈化作用[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2006（4）：11 - 13.

[9] 顧宏，徐君，張賢明，等.孔石莼對養(yǎng)殖廢水中營養(yǎng)鹽的吸收研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30（7）：85 - 87，120.

[10] 岳維忠，黃小平，黃良民，等.大型藻類凈化養(yǎng)殖水體的初步研究[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2004，23（1）：13 -15，40.

[11] 呂冬偉，劉峰，李興佐.大型海藻孔石莼在工廠化海水養(yǎng)殖中的生物修復(fù)及其應(yīng)用前景[J].海洋科學(xué)，2012，36（12）：95 -98.

[12] 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心.海洋監(jiān)測規(guī)范：第4部分海水分析：GB 17378.42007[S].北京：中國標準出版社，2007：109 - 119.

[13] Harrison P J.Parslow J S，Conway H L.Determination of nutri-ent uptake kinetic parameters： a comparison of methods[J].Marine Ecology Progress Series， 1989， 52： 301 - 312.

[14] Pedersen M F，Paling E I，Walker D I.Nitrogen uptake andallocation in the seagrass Amphibolis Antarctica[J]. AquaticBotany. 1997， 56： 105 - 117.

[15] 李秀辰，張國琛，崔引安，等.孔石莼對養(yǎng)鮑污水的靜態(tài)凈化研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，1998，14（1）：173 - 176.

[16] Brinkhuis B H. Li R. Wu C， et al.Nitrite uptake transientsand consequences for in vivo algal nitrate reductase assays[J].Journal of Phycology， 1989， 25： 539 - 545.

[17] 李再亮，申玉春，謝恩義，等.羊棲菜對氮、磷的吸收速率研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011.40（3）：73 - 77.

[ 18] Liu J，Vyverman W. Differences in nutrient uptake capacity ofthe benthic filamentous algae Cladophora sp.，Klebsormidium-WTBZ sp. and Pseudanabaena sp. under varying N/P condi-tions[J].Bioresource Technology， 2015， 179： 234 - 242.

[19] Pedersen M F. Transient ammonium uptake in the macroalgaeUlva lactuca（ chlorophyta） - nature， regulation， and the conse-quences for choice of measuring technique[J].Joumal of Phv-cology， 1994 ，30（6）：980 - 986.