陳 鑫，李然紅，劉 丹，王立鳳

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.) Maxim.〕，別名狗棗子，大型落葉藤本植物，主要分布于我國東北、河北、云南等地。狗棗獼猴桃是最耐寒的獼猴桃品種之一，為良好的抗寒育種資源，其在生長發(fā)育過程中葉片顏色會發(fā)生動態(tài)變化，形成白、粉、淺紅和淺綠的斑狀彩葉，其果實柔軟多汁、酸甜可口、富含維生素C，是一種藥食觀賞兼用植物[1-3]。鋅指蛋白(zinc finger proteins，ZFP)是指含有通過結合Zn2+可以自我折疊形成“手指”結構的一類蛋白質，主要由半胱氨酸和組氨酸殘基與Zn2+結合成立體結構[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，鋅指蛋白參與植物的生長發(fā)育、逆境脅迫應答等功能，并廣泛存在于動植物和微生物中。WU等[6-7]研究表明，ZFP可以激活水稻種子中赤霉素(GA)合成基因表達，從而打破種子休眠，提高發(fā)芽率，ZFP8通過調節(jié)細胞分裂素(CK)的信號傳導，能夠促進擬南芥的細胞分化，促進植株生長。ZFP能夠在低溫、干旱、鹽堿等脅迫環(huán)境中發(fā)揮重要作用，番茄、枳、煙草、大豆中的鋅指蛋白ZFP均在逆境環(huán)境中大量表達，巨桉的EgrZFP6能夠參與脅迫響應的負調控，提高植物對低溫的敏感性[8-10]。有關狗棗獼猴桃ZFP基因的研究國內尚未見報道。因此，筆者以狗棗獼猴桃轉錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到鋅指蛋白的cDNA序列，利用生物信息學方法對其理化性質、疏水性/親水性、蛋白結構功能域、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點及同源性等方面進行預測和分析，以期為狗棗獼猴桃ZFP蛋白功能研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃鋅指蛋白cDNA序列從牡丹江師范學院植物遺傳育種課題組經試劑盒提取植物總RNA，反轉錄后送測序公司獲得；胡桃(Juglansregia，XP_018811460.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002278326.1)、羅布斯塔咖啡(Coffeacanephora，CDP13009.1)、小?？Х?CoffeaArabica，XP_027084413.1)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002519824.1)、木薯(Manihotesculenta，XP_021599867.1)、可可樹(Theobromacacao，XP_017972715.1)、胡楊(Populuseuphratica，XP_011028187.1)、毛果楊(Populustrichocarpa，XP_006385648.1)、黃燈籠辣椒(Capsicumchinense，PHU28666.1)、辣椒(Capsicumannuum，XP_016554111.1)、黃麻(Corchoruscapsularis，OMP11099.1)、漿果狀辣椒(Capsicumbaccatum，PHT58273.1)、土瓶草(Cephalotusfollicularis，GAV69097.1)、橙子(Citrussinensis，KDO42906.1)、橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP_021679968.1)、番木瓜(Caricapapaya，XP_021912676.1)、榴蓮(Duriozibethinus，XP_022772370.1)、水芙蓉(Nelumbonucifera，XP_010269999.1)、中華獼猴桃原變種(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS11627.1)等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

狗棗獼猴桃AkZFP的理化性質用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進行分析；NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/ interpro/search/sequence-search)預測功能位點；NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk /services/NetNGlyc/)對N-糖基化位點進行預測；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetOGlyc/)對O-糖基化位點進行預測；采用SOPMA及PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(https://www.predictprotein.org/)對AkZFP進行二級結構及蛋白質修飾位點預測；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預測蛋白質三級結構。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲得20條不同植物的ZFP氨基酸序列信息，利用MEGA5.1軟件的Neighbor-joining法構建蛋白質系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 AkZFP的理化性質

經分析表明，AkZFP基因cDNA全長為788 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第56～733個堿基，共編碼226個氨基酸，分子量24 778.46 Da，理論等電點為5.61，負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為21，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為13，分子式為C1082H1649N309O342S10，總原子數(shù)3 392，不穩(wěn)定指數(shù)(instability index,Ⅱ)為51.78，脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為64.03，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.549，說明該蛋白為親水非穩(wěn)定性蛋白。該蛋白中含量最多的為絲氨酸，占11.5%;其次為脯氨酸和亮氨酸，各占10.2%和9.3%;含量最少的為賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸，均為1.8%(圖1)，吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量為0。通過ProtScale軟件分析預測(圖2)，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為1.689,在119個氨基酸處;最小值為-3.122,在第203個氨基酸處。從整體分布看，氨基酸的負值多且分值大，根據(jù)蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

圖1 狗棗獼猴桃ZPF基因編碼蛋白質的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theZPFgene ofA.kolomikta

圖2 AkZFP的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity of AkZFP

2.2 AkZFP的信號肽及跨膜結構

經SignalP-4.1預測(圖3)，AkZFP蛋白不含信號肽，同時不存在跨膜結構。

注：C值，S值和Y值分別是原始剪切位點、信號肽和綜合剪切位點的分值。

Note:The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkZFP蛋白信號肽及跨膜結構

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkZFP

2.3 AkZFP的結構域預測

經對AkZFP保守序列及蛋白家族預測表明(圖4)，AkZFP是ZFP基因家族的ZF-C2H2-6成員，其第76～100氨基酸的序列區(qū)域為ZFP6組的保守結構域。

圖4 AkZFP蛋白的保守序列

Fig.4 Conservative protein sequence of AkZFP

2.4 AkZFP的二級、三級結構

經對AkZFP的二級結構進行預測(圖5)，該蛋白21.68%可能會形成螺旋，12.83%可能形成延伸鏈，2.65%可能形成轉角，62.83%為無規(guī)卷曲，無二硫鍵的形成和特殊的二級結構。用SWISS-MODEL對AkZFP蛋白進行三級結構預測，結果(圖6)顯示，AkZFP的功能結構域在第73～105個氨基酸上，同時含有QALGGH手指結構。

圖5 AkZFP蛋白的二級結構預測

Fig.5 Secondary structure prediction of AkZFP protein

圖6 AkZFP蛋白的三級結構預測

Fig.6 Tertiary structure prediction of AkZFP protein

2.5 AkZFP的蛋白質修飾位點

經預測，該蛋白內有5個潛在的N-糖基化位點，分別在15(NISH)、30(NPSY)、162(NKSL)、183(NSSL)及203(NHTN)氨基酸處。NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點進行預測，預測分數(shù)均大于0.5的認為是陽性，故推測該蛋白內含23個O-糖基化位點。AkZFP含有4個糖基化位點(N-glycosylation site)分別在第15個、162個、183個、203個氨基酸處，1個酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site)在190個氨基酸處，1個十四烷?；稽c(N-myristoylation site)在92個氨基酸處，1個鋅指C2H2型結構域(Zinc finger C2H2 type domain signature)序列在78個氨基酸處。

2.6 AkZFP的氨基酸序列同源性

狗棗獼猴桃AkZFP氨基酸序列經與NCBI數(shù)據(jù)庫中的20種植物氨基酸進行同源性比對表明，狗棗獼猴桃AkZFP與中華獼猴桃原變種親緣關系較近，而與羅布斯塔咖啡、蓖麻等植物親緣關系較遠(圖7)。

圖7 ZFP的系統(tǒng)進化樹

Fig.7 System phylogenetic tree of ZFP

3 討論

鋅指蛋白直接或間接參與植物的生長發(fā)育、根系建成、逆境響應及信號調節(jié)等生理生化過程。目前已經從多種植物中克隆到ZFP基因包括擬南芥、大豆、小麥、水稻、矮牽牛等[11]。根據(jù)半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和位置分為C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H等多種類型，在植物中具有高度保守基因序列QALGGH。試驗利用已測的狗棗獼猴桃轉錄組數(shù)據(jù)，篩選出狗棗獼猴桃ZFP基因cDNA序列信息，并對其進行了生物信息學分析。結果表明：ZFP基因cDNA全長為788 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第56～733個堿基，共編碼226個氨基酸，是ZFP-6(PFAM13912)家族的一員，C2H2型，包含1個QALGGH保守序列，屬于親水性、非穩(wěn)定的蛋白，蛋白中絲氨酸、脯氨酸和亮氨酸含量較高，沒有跨膜結構。AkZFP在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，顯示與狗棗獼猴桃ZFP相比序列中，一致性最高的為90.32%，最低的為44.18%。選取20種植物的氨基酸序列與AkZFP進行比對得出，AkZFP與中華獼猴桃原變種親緣關系較近，而與羅布斯塔咖啡、蓖麻等植物親緣關系較遠。為進一步研究狗棗獼猴桃鋅指蛋白基因功能提供了一定的理論基礎。