朱小穎，溫樂(lè)蛟，馬博謀，，曹秀明，侯秀良

(1.江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇陽(yáng)光股份有限公司，江蘇 江陰 214426)

谷朊粉是小麥淀粉加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，其中蛋白質(zhì)含量75%～85%，延伸性和生物相容性比其他植物蛋白更好，是制備高品質(zhì)生物材料的理想原料[1]。但限制其纖維應(yīng)用的主要問(wèn)題之一是穩(wěn)定性較差。目前，解決的主要方法是對(duì)纖維進(jìn)行交聯(lián)處理[2]，對(duì)蛋白進(jìn)行交聯(lián)多使用戊二醛[3]、谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶[1]等，其中戊二醛交聯(lián)處理過(guò)程有甲醛等有害物質(zhì)；谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶價(jià)格貴，對(duì)反應(yīng)條件要求高。檸檬酸安全無(wú)毒，價(jià)格低廉，作為谷朊纖維的交聯(lián)劑更具有實(shí)用價(jià)值。

本文基于研究室研究檸檬酸交聯(lián)處理谷朊纖維的力學(xué)性能的基礎(chǔ)上[4-5]，深入研究了此方法對(duì)谷朊纖維穩(wěn)定性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

谷朊粉(蛋白質(zhì)含量86%)，無(wú)錫山紫凌云商貿(mào)有限公司；一水合檸檬酸、亞硫酸鈉、硫酸鈉、尿素均為分析純。

XL-21濕法紡絲機(jī)；GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 谷朊纖維制備 采用濕法紡絲方法制備谷朊纖維，過(guò)程見(jiàn)圖1。

1.2.2 交聯(lián)處理 對(duì)纖維的交聯(lián)處理采用檸檬酸水溶液浸泡法，處理后的纖維同樣進(jìn)行第二次牽伸、干燥和熱處理[4]，得到交聯(lián)谷朊纖維，其過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 谷朊纖維和交聯(lián)處理后的谷朊纖維的制備流程圖Fig.1 Preparation scheme of gluten fibers and crosslinked gluten fibers

1.3 纖維結(jié)構(gòu)測(cè)試方法

1.3.1 谷朊分子量 制備濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為10%的SDS-PAGE凝膠，將樣品剪碎，用瑪瑙研缽研磨成粉末，溶解于蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，制成電泳上樣液。將靜置后的凝膠裝進(jìn)電泳儀，倒入甘氨酸緩沖液，上樣跑膠，跑膠結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3 h，脫色液脫色3 h后拍照[5]。

1.3.2 谷朊大分子構(gòu)象 將測(cè)試樣品保存在干燥皿中，測(cè)試前在85 ℃熱空氣中烘干2 h，試驗(yàn)臺(tái)使用氮?dú)獯祾吲懦指蓴_。采用ATR法采集測(cè)試樣品的紅外光譜信息。對(duì)紅外光譜圖酰胺Ⅰ區(qū)的處理采用FSD法分峰和曲線擬合法分峰。

1.4 纖維穩(wěn)定性能測(cè)試方法

1.4.1 熱穩(wěn)定性

1.4.1.1 差示掃描量熱分析(DSC) 測(cè)試前將樣品用瑪瑙研缽在紅外燈下研磨成粉末，稱取質(zhì)量相近的試樣坩堝與對(duì)比坩堝，稱取5 mg左右的樣品裝入試樣坩堝中并密封。將試樣坩堝與對(duì)比坩堝放入DSC測(cè)試儀器開(kāi)始測(cè)試，測(cè)試范圍0～260 ℃，升溫速率5 ℃/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min。

1.4.1.2 熱重分析(TG) 測(cè)試前將樣品用瑪瑙研缽在紅外燈下研磨成粉末，稱取5～10 mg的樣品粉末用于測(cè)試，測(cè)試范圍0～500 ℃，升溫速率 20 ℃/min。

1.4.2 耐水解穩(wěn)定性 把谷朊纖維和交聯(lián)谷朊纖維在不同pH值(4，7，9)和不同溫度(25，30，37，40，45 ℃)緩沖溶液下處理，浴比為1∶200，以緩沖體系中溶解出的蛋白含量評(píng)價(jià)纖維的水解穩(wěn)定性。

紫外分光光度計(jì)法測(cè)試蛋白質(zhì)含量。每隔一定的時(shí)間，吸取一定量的蛋白溶液(并補(bǔ)充相應(yīng)體積的空白溶液)，根據(jù)緩沖液278 nm處吸光度A278在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出緩沖液中蛋白質(zhì)的濃度[6]。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬酸交聯(lián)對(duì)谷朊纖維熱穩(wěn)定性的影響

谷朊粉、谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維的DSC曲線見(jiàn)圖2。

圖2 谷朊粉、谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維DSC曲線Fig.2 DSC curves for gluten，gluten fibers，cross-linked gluten fibers

由圖2可知，谷朊粉、谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維均有一個(gè)較強(qiáng)的水分揮發(fā)峰，谷朊粉的峰尖位于83.75 ℃處，而谷朊纖維和交聯(lián)谷朊纖維的峰位都向高溫方向偏移，分別為88.31，95.20 ℃，很明顯谷朊纖維的峰面積大于交聯(lián)谷朊纖維。前者由于谷朊粉結(jié)構(gòu)松散，大分子二級(jí)結(jié)構(gòu)雜亂，疏水基團(tuán)外露較多，疏水性強(qiáng)；而谷朊纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)緊密，且凝固時(shí)，疏水基團(tuán)向分子內(nèi)部移動(dòng)[7]，大分子的親水能力提高，升溫過(guò)程中水分流失速度相對(duì)較慢。而后者交聯(lián)作用產(chǎn)生的差異，則是由于谷朊纖維大分子間產(chǎn)生交聯(lián)作用，纖維結(jié)構(gòu)趨于緊密，纖維含水量下降，水分揮發(fā)峰減小，升溫的過(guò)程中水分揮發(fā)的難度上升，水峰向高溫方向偏移。谷朊粉、谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維的熔融峰分別位于208.02，209.65，211.04 ℃處，溫度向高溫方向偏移，這可能是由于蛋白質(zhì)分子量的上升。分子量上升，蛋白質(zhì)大分子克服阻礙內(nèi)旋轉(zhuǎn)的勢(shì)能難度以及分子構(gòu)象改變的難度都隨之上升，所以通常情況下分子量增加后熔融溫度會(huì)有所上升。

谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維的TG曲線見(jiàn)圖3。

圖3 谷朊纖維(a)、交聯(lián)谷朊纖維(b)TG曲線Fig.3 TG curves for gluten fibers(a) and cross-linked gluten fibers(b)

由圖3可知，纖維的熱失重主要分為三個(gè)階段：階段1在0～150 ℃由于水分揮發(fā)失重，階段2在150～340 ℃區(qū)間共價(jià)肽鍵斷裂導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分解失重，階段3在340～500 ℃區(qū)間由于S—S鍵、O—N鍵、O—O斷裂導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分解失重[8-9]。與谷朊纖維相比，交聯(lián)谷朊纖維失重率在階段2減少1.09%，在階段3增加2.89%，且初始溫度偏小，這可能是由于檸檬酸對(duì)蛋白質(zhì)大分子的交聯(lián)作用使得一部分不含二硫鍵的肽鏈與含二硫鍵的肽鏈發(fā)生交聯(lián)，這部分肽鏈?zhǔn)芘c之相近的二硫鍵的影響，熱學(xué)性能相對(duì)穩(wěn)定，在共價(jià)肽鍵發(fā)生斷裂的階段2沒(méi)有發(fā)生分解，但其在二硫鍵斷裂后熱學(xué)穩(wěn)定性迅速下降從而發(fā)生分解，即階段3的初始溫度偏小。因此，交聯(lián)谷朊纖維熱學(xué)性能總體上是上升的。

2.2 檸檬酸交聯(lián)對(duì)谷朊纖維水解穩(wěn)定性的影響

在溫度37 ℃、不同pH值下谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維的水解穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著水解時(shí)間的增加，浸泡谷朊纖維和交聯(lián)纖維的pH 4緩沖液中蛋白質(zhì)的濃度幾乎不增加；而浸泡谷朊纖維和交聯(lián)谷朊纖維的pH 9緩沖液中的蛋白質(zhì)濃度略微上升，在48 h時(shí)分別達(dá)到0.45 mg/mL和0.40 mg/mL；浸泡谷朊纖維和交聯(lián)谷朊纖維的pH 7緩沖液中的蛋白質(zhì)濃度在48 h時(shí)分別達(dá)到3.8 mg/mL和3.0 mg/mL。與谷朊纖維相比，交聯(lián)谷朊纖維在不同pH值下水解穩(wěn)定性均有所上升，這是由于檸檬酸對(duì)谷朊纖維的交聯(lián)作用使得大分子間和分子內(nèi)的肽鍵增多，其在水解過(guò)程中斷裂出小分子的可溶性蛋白質(zhì)所需的時(shí)間也相對(duì)增加，因此交聯(lián)作用后的纖維水解穩(wěn)定性上升。另外，無(wú)論交聯(lián)與否，谷朊纖維在pH 4，9的緩沖液中蛋白質(zhì)損失的量均小于pH 7的緩沖液。究其原因，谷朊大分子的等電點(diǎn)偏酸性，在pH 4時(shí)谷朊大分子的溶解度較低，其水解穩(wěn)定性較好，而pH 7的磷酸鹽緩沖液與pH 9的硼酸緩沖液都能與蛋白質(zhì)大分子發(fā)生作用，但磷酸鹽緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)大分子的影響更加劇烈，能夠使其帶有負(fù)電荷[10]，因此pH 7的緩沖液中蛋白質(zhì)濃度較高。

圖4 谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維在不同pH下的水解穩(wěn)定性(水解溫度37 ℃)Fig.4 Hydrolytic stability of gluten fibers，cross-linked gluten fibers at different pH (hydrolysis temperature 37 ℃)

在pH為7，不同溫度下谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維的水解穩(wěn)定性見(jiàn)圖5。

圖5 谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維在不同溫度下的水解穩(wěn)定性(pH 7)Fig.5 Hydrolytic stability of gluten fibers，cross-linked gluten fibers at different temperatures (pH 7)

由圖5可知，在溫度為25 ℃和30 ℃條件下保溫48 h，交聯(lián)與未交聯(lián)纖維的緩沖液中蛋白質(zhì)濃度相對(duì)穩(wěn)定，均低于1 mg/mL。隨著溫度升高，緩沖液中蛋白質(zhì)的濃度增加，速度趨于劇烈，37 ℃、48 h下的緩沖液中蛋白質(zhì)濃度分別為3.81 mg/mL和3.04 mg/mL。隨著溫度的升高，纖維的穩(wěn)定性繼續(xù)下降。45 ℃、48 h 下則分別為5.23 mg/mL和4.25 mg/mL。由此可知，交聯(lián)處理能夠有效提高谷朊纖維的水解穩(wěn)定性，同時(shí)谷朊纖維的水解穩(wěn)定性也隨溫度的升高而降低。前者是由于檸檬酸對(duì)于谷朊纖維的交聯(lián)作用使得大分子間和分子內(nèi)的肽鍵增多，其在水解過(guò)程中斷裂出小分子的可溶性蛋白質(zhì)所需的時(shí)間也相對(duì)增加，因此交聯(lián)谷朊纖維的水解穩(wěn)定性上升。后者則由于溫度升高，蛋白質(zhì)大分子的鏈段運(yùn)動(dòng)趨于劇烈，纖維溶脹程度高。

2.3 檸檬酸交聯(lián)對(duì)谷朊纖維分子量的影響

谷朊纖維與交聯(lián)谷朊纖維的SDS-PAGE見(jiàn)圖6。

圖6 谷朊纖維(a)、交聯(lián)谷朊纖維(b)SDS-PAGE圖Fig.6 Gluten fibers(a) and cross-linked gluten fibers(b) SDS-PAGE figure

由圖6可知，谷朊纖維經(jīng)過(guò)檸檬酸溶液交聯(lián)處理后分子量在100 k以上的大分子數(shù)量明顯增多，表明谷朊纖維經(jīng)過(guò)檸檬酸溶液交聯(lián)處理后，蛋白質(zhì)大分子間產(chǎn)生交聯(lián)作用，分子量明顯上升。

在交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程中，檸檬酸-蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生圖7a所示的親核取代反應(yīng)，最終的交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物見(jiàn)圖7b[11]。

a.檸檬酸羧基與谷朊蛋白質(zhì)分子氨基親核取代反應(yīng)b.檸檬酸-谷朊蛋白分子交聯(lián)反應(yīng)圖7 檸檬酸-谷朊蛋白分子交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理Fig.7 Cross-linking reaction mechanism between citric acid and gluten protein molecules

2.4 檸檬酸交聯(lián)對(duì)谷朊纖維大分子構(gòu)象的影響

谷朊粉、谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維FTIR圖譜見(jiàn)圖8。

圖8 谷朊粉(a)、谷朊纖維(b)、交聯(lián)谷朊纖維(c)FTIR圖Fig.8 FTIR for gluten(a)，gluten fibers(b) and cross-linked gluten fibers(c)

由圖8可知，谷朊粉、谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維FTIR圖譜都是十分相似的，而主要發(fā)生變化的則為其酰胺區(qū)峰位波數(shù)的移動(dòng)，這主要是由于蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象的變化。與谷朊粉相比，谷朊纖維紅外酰胺區(qū)峰位向低波數(shù)平移，這主要由于谷朊粉中蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象以紅外吸收峰在高波數(shù)處的α螺旋構(gòu)型為主，而谷朊纖維蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象則以低波數(shù)處的β折疊構(gòu)型為主。谷朊粉在酰胺Ⅱ區(qū)的峰形為雜亂的平臺(tái)形，而谷朊纖維的酰胺Ⅱ區(qū)峰形圓滑整齊，尤其是還原劑對(duì)二硫鍵的破壞并重建這一過(guò)程后[12]，谷朊纖維中的蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象趨于統(tǒng)一，故而酰胺Ⅱ區(qū)峰形趨于平滑。另外，由圖8可以看出，交聯(lián)谷朊纖維的紅外光譜與谷朊粉的更為接近，與谷朊粉相比，酰胺Ⅰ區(qū)峰和酰胺Ⅱ區(qū)峰向高波數(shù)移動(dòng)。究其原因，可能是谷朊纖維在檸檬酸溶液中受到堿性條件的影響，蛋白質(zhì)大分子發(fā)生一定的變形，原本由于紡絲形成的相對(duì)統(tǒng)一的構(gòu)象發(fā)生了變化，在高波數(shù)區(qū)的構(gòu)象增多。

蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺Ⅰ區(qū)對(duì)于研究構(gòu)象最有價(jià)值，對(duì)谷朊粉、谷朊纖維以及交聯(lián)谷朊纖維的紅外光譜酰胺Ⅰ區(qū)分峰見(jiàn)圖9。

圖9 谷朊粉(a)、谷朊纖維(b)、交聯(lián)谷朊纖維(c)FTIR酰胺Ⅰ區(qū)分峰圖Fig.9 Peak fits of FTIR amide I areas for gluten(a)，gluten fibers(b) and cross-linked gluten fibers(c)

由圖9可知，谷朊粉中蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象復(fù)雜多樣，1 688，1 676 cm-1以及1 610～1 640 cm-1處出現(xiàn)β-折疊峰，1 652 cm-1處出現(xiàn)明顯的α-螺旋峰，1 643 cm-1處出現(xiàn)明顯的無(wú)規(guī)卷曲峰，而谷朊纖維中大分子構(gòu)象峰相對(duì)較少，主要是出現(xiàn)在1 690 cm-1處的β-轉(zhuǎn)角或β-折疊峰，1 649 cm-1處的無(wú)規(guī)卷曲峰，β-折疊區(qū)僅有1 621 cm-1處的弱氫鍵β-折疊峰。這主要是由于谷朊粉中的蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象雜亂，但經(jīng)過(guò)尿素溶液溶解后紡絲，尤其是還原劑對(duì)二硫鍵破壞并重建后，谷朊纖維中的蛋白質(zhì)大分子構(gòu)象趨于統(tǒng)一。

與谷朊纖維相比較，交聯(lián)谷朊纖維的構(gòu)象發(fā)生明顯變化。其中β-折疊分化為兩個(gè)峰：位于1 610 cm-1處的強(qiáng)氫鍵β-折疊峰和位于1 627 cm-1處的弱氫鍵β-折疊峰。同時(shí)1 690 cm-1處的β-轉(zhuǎn)角峰弱化，1 666 cm-1處的β-轉(zhuǎn)角峰變明顯，無(wú)規(guī)卷曲峰向低波數(shù)偏移至1 647 cm-1處。1 594 cm-1處的谷氨酰胺側(cè)鏈(NH2)峰變明顯，更接近于谷朊粉。究其原因，可能是谷朊纖維在檸檬酸溶液中受到堿性條件的影響，蛋白質(zhì)大分子發(fā)生一定的變形，原本由于紡絲形成的相對(duì)統(tǒng)一的構(gòu)象發(fā)生了變化，在高波數(shù)區(qū)的構(gòu)象增多。

谷朊粉、谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維酰胺Ⅰ區(qū)FTIR構(gòu)象與含量對(duì)比見(jiàn)表1。

由表1可知，谷朊粉中大分子構(gòu)象以β-折疊為主，而交聯(lián)谷朊纖維中的β-折疊構(gòu)象數(shù)量增多且發(fā)生分化，通過(guò)構(gòu)象的含量充分說(shuō)明了谷朊纖維經(jīng)過(guò)檸檬酸溶液交聯(lián)處理后，蛋白質(zhì)大分子間確實(shí)是產(chǎn)生了交聯(lián)作用，使之構(gòu)象增多。另外可以明顯看出，谷朊粉紡絲成谷朊纖維后α-螺旋結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有了。

表1 谷朊粉、谷朊纖維、交聯(lián)谷朊纖維FTIR二級(jí)結(jié)構(gòu)與含量對(duì)比

3 結(jié)論

(1)檸檬酸交聯(lián)處理可有效提高谷朊纖維中蛋白質(zhì)大分子分子量，尤其在大分子量100 k以上有顯著體現(xiàn)。

(2)檸檬酸交聯(lián)處理可使大分子β-折疊構(gòu)象數(shù)量增多，無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象數(shù)量明顯減少，大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

(3)檸檬酸交聯(lián)谷朊纖維結(jié)構(gòu)上的變化直接導(dǎo)致了熱穩(wěn)定性的提高，TG圖中各個(gè)峰值都向高溫偏移。

(4)檸檬酸交聯(lián)谷朊纖維結(jié)構(gòu)上的變化直接導(dǎo)致了水解穩(wěn)定性的提高，在pH 7處，很明顯水解穩(wěn)定性提高了21%。