劉曉光, 陳佩杰, 趙淋淋, 曾志剛,2, 肖衛(wèi)華

(1.上海體育學院 運動科學學院,上海 200438; 2.井岡山大學 體育學院,江西 吉安 343000)

骨骼肌是人體最重要的器官之一,約占體質(zhì)量的40%。骨骼肌收縮牽拉骨骼繞關節(jié)轉(zhuǎn)動,為人體運動提供動力。骨骼肌具有較強的損傷后再生能力,而這種再生能力主要依賴于肌衛(wèi)星細胞[1]。肌衛(wèi)星細胞是一種肌原性前體細胞,存在于肌細胞膜和基底膜之間。當骨骼肌損傷時,肌衛(wèi)星細胞被激活,然后增殖分化,與受損肌纖維融合,修復損傷骨骼肌[2]。

近年來研究表明,巨噬細胞在骨骼肌損傷修復過程中也具有重要作用,它不僅參與損傷后肌衛(wèi)星細胞的激活,還促進壞死肌纖維及細胞碎片的清除,調(diào)節(jié)炎癥反應[3]。骨骼肌損傷后,巨噬細胞在多種因素刺激下游離到損傷部位,參與損傷組織修復[4]。研究發(fā)現(xiàn),趨化因子在骨骼肌損傷后巨噬細胞的趨化中發(fā)揮了重要作用[5-6]。在骨骼肌挫傷這一特定病理狀態(tài)下,巨噬細胞如何趨化到損傷部位卻鮮有研究。因此,本文建立了骨骼肌挫傷模型,通過HE染色觀察骨骼肌挫傷后修復過程中的形態(tài)學變化,通過RT-PCR檢測骨骼肌挫傷后巨噬細胞和趨化因子的時空表達規(guī)律,并對巨噬細胞和趨化因子表達進行相關性分析,以探索骨骼肌挫傷后巨噬細胞趨化的具體機制。這將加深對骨骼肌挫傷修復機制的理解與認識,為研制治療骨骼肌挫傷的藥物提供新的思路,具有潛在的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組8～10周齡健康ICR雄性小鼠66只,購自上海杰思捷實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～25℃,濕度為40%～50%,12 h光照,12 h黑暗,自由飲食。隨機選取11只作為對照組(C組),余下進行腓腸肌挫傷處理,分為傷后12 h、1 d、5 d、10 d和15 d組,每組11只。

1.2 骨骼肌挫傷模型小鼠用400 mg/kg體質(zhì)量水合氯醛腹腔注射麻醉后,膝關節(jié)伸直0°,踝關節(jié)背伸90°位,將質(zhì)量16.8 g,直徑15.9 mm的實心不銹鋼鋼珠置于一透明管道頂端(高100 cm,內(nèi)徑16.0 mm)釋放后垂直擊中一打擊裝置,打擊裝置底端撞擊小鼠雙側(cè)腓腸肌肌腹中段(打擊面積28.26 mm2)。骨骼肌挫傷后,可見腓腸肌血腫,HE染色可見肌纖維腫脹、壞死、紅細胞滲出和炎性細胞浸潤。此法已多次被驗證可成功建模[7-9]。

1.3 動物取材小鼠腓腸肌挫傷后在不同時間點(12 h、1 d、5 d、10 d和15 d)取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死,迅速取雙側(cè)受損腓腸肌。其中3只小鼠共6條腿腓腸肌進行HE染色,剩余8只小鼠的左腿腓腸肌用于熒光定量PCR檢測。

1.4 HE染色小鼠腓腸肌取材,經(jīng)4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn))固定后,用石蠟(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn))包埋,然后于切片機(Leica-EG 1 160,德國產(chǎn))切3～4 μm的薄片。切片經(jīng)脫蠟處理后,用蘇木素-伊紅染色,然后中性樹膠封片。20倍物鏡下觀察并拍照(Labphot-2,Nikon,美國產(chǎn))。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 RNA抽提 稱重骨骼肌(約50 mg),并將組織剪碎,然后放入2 mL離心管中,加入1 mL Trizol(Invitrogen公司產(chǎn));機械勻漿器(IKA,德國產(chǎn))勻漿5～6次,每次10 s,靜置5 min后,13 400g離心(centrifuge5 417R,德國Eppendorf公司產(chǎn))10 min,然后取上清(約800～900 μL)放入1.5 mL離心管中;每使用1 mL Trizol加200 μL氯仿(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)),劇烈震蕩15 s,然后靜置3 min;4 ℃條件下,13 400g離心10 min后,樣品分為3層,中間層和上層是無色水相,RNA主要在水相中(約500 μL),將RNA轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中;在得到的水相中,加入等體積異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)),混勻,室溫放置20～30 min;4 ℃條件下13 400g離心10 min后,棄上清,離心后RNA沉在管底,呈微小羽毛狀;加入1 mL 75%的乙醇(國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn))洗滌2次;在4 ℃條件下2 300g離心5 min,棄上清;干燥5 min后,加入30～100 μL DEPC水(生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)),分析RNA的濃度或放-20 ℃短期保存,-80 ℃長期保存。

1.5.2 cDNA合成 cDNA合成按RevertAid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說明進行,取2 μg總RNA、1μL隨機六聚體引物、4μL 5X Reaction Buffer、1μL RiboLockTMRNA酶抑制劑 (20 u/μL)、2μL 10 mmol/L dNTP Mix、1μL RevertAidTMM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 u/μL)和適量無RNA酶高純水,總體積共20μL。于梯度 PCR儀(Mastercycler EP,德國 Eppendorf 公司產(chǎn))進行逆轉(zhuǎn)錄。反應過程中的溫度和時間控制是25 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min,然后溫度降低到4 ℃,cDNA合成完成。

1.5.3 熒光定量PCR 熒光定量PCR反應體系包括12.5 μL 2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master mix (Thermo Scientific)、1μL cDNA、無核酸酶水和300 nmol/L的上下游引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。 使用熒光定量PCR儀進行擴增。反應條件為:預變性95 ℃ 10 min,然后95 ℃變性 15 s,60 ℃ 1 min共 40個循環(huán)。 通過2-△△CT方法計算所測樣本mRNA的相對含量[10-11]。

1.6 統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理,結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。One-way ANOVA和Bonferroni事后檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 挫傷骨骼肌修復過程中形態(tài)學變化骨骼肌挫傷后,在傷后12 h～1 d組,取材時可見腓腸肌表面有明顯血腫,特別是傷后12 h組最明顯,5 d組開始有所改善,14 d和21 d組已觀察不到此現(xiàn)象。HE染色結(jié)果表明,未損傷骨骼肌形態(tài)規(guī)則,細胞核分布于肌膜下,無壞死肌纖維。骨骼肌挫傷后12 h～1 d,肌纖維腫脹、結(jié)構完整性被破壞,出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。傷后第5天仍有較多炎性細胞浸潤,但出現(xiàn)少量再生肌纖維(中央成核肌纖維)。傷后第10天再生肌纖維數(shù)量大大增加,傷后第15天仍見少量再生肌纖維,但肌纖維結(jié)構較完整,損傷后修復基本完成(圖1)。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer Sequences for PCR

圖1 挫傷骨骼肌形態(tài)學變化Figure 1 Morphological changes of skeletal muscles after contusion

2.2 骨骼肌挫傷后巨噬細胞標志物表達變化RT-PCR結(jié)果顯示,骨骼肌挫傷后CD68(M1巨噬細胞標志物)[8]mRNA表達升高,且在挫傷后第1天達到峰值(P<0.01),第5天仍顯著高于對照組(P<0.01)。CD206為M2a巨噬細胞標志物[8],與對照組相比,在挫傷后5 d和10 d均顯著增加,且第10天達到峰值(P<0.01)。CD163作為M2c巨噬細胞標志物[12],與對照組相比,在挫傷后第10天表達顯著增加(P<0.01)(圖2)。

2.3 骨骼肌挫傷后趨化因子表達變化如圖3 所示,與損傷組相比,單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)在骨骼肌挫傷后12 h顯著增加并達峰值(P<0.01),且在傷后1 d、5 d和15 d仍顯著增加(P<0.01)[圖3(a)]。CC趨化因子受體2(CCR2)在挫傷后1 d、5 d和15d mRNA表達均顯著高于對照組(P<0.01)[圖3(b)]?；|(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)mRNA在挫傷后12 h、10 d和15 d表達均顯著增加[圖3(c)]。CXC趨化因子受體4(CXCR4)雖在骨骼肌挫傷后表達出現(xiàn)變化,但與對照組相比并無顯著差異(P>0.05)[圖3(d)]。

2.4 巨噬細胞與趨化因子的相關性分析通過皮爾遜相關分析發(fā)現(xiàn),骨骼肌挫傷后,MCP-1與CD68存在強相關(r=0.654,P=0.001),與其受體CCR2呈強相關(r=0.617,P=0.015),與CD163和CD206無相關。SDF-1與其受體CXCR4呈相關(r=0.187,P=0.023),與CD68、CD163和CD206均無相關(表2)。

圖2 骨骼肌挫傷后巨噬細胞標志物表達變化Figure 2 The expression changes of macrophages markers after skeletal muscle contusion

表2 趨化因子與其受體及巨噬細胞標志物的相關性
Table 2 Correlation between thechemokines and their receptors and markers of macrophages

注:*表示無相關;—表示未進行相關分析

3 討論

3.1 骨骼肌挫傷模型的構建Ceafalan等[13]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌壓碎性損傷后,大量肌纖維壞死、炎性細胞浸潤,在傷后第5天首次發(fā)現(xiàn)中央成核肌纖維(再生肌纖維),傷后第14天大部分再生肌纖維已成熟。本實驗結(jié)果與Ceafalan等的結(jié)果相似,骨骼肌挫傷后肌纖維壞死、腫脹、大量炎性細胞浸潤,傷后第7天有大量再生肌纖維,傷后第14天大部分再生肌纖維已成熟。與之不同的是,在本實驗中,骨骼肌挫傷后第3天即可見少量再生肌纖維。出現(xiàn)這種差異的原因可能是骨骼肌壓碎傷較挫傷更為嚴重,因此再生肌纖維出現(xiàn)得較晚。此外,Wright等[14]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌挫傷后第7天,損傷部位出現(xiàn)大量再生肌纖維。Nozaki等[15]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌挫傷后第14天,損傷骨骼肌仍有少量再生肌纖維,大部分再生肌纖維已成熟。以上結(jié)果與本文相似,提示骨骼肌挫傷模型建立成功[7,16]。

3.2 骨骼肌挫傷后巨噬細胞浸潤的規(guī)律巨噬細胞在骨骼肌損傷修復過程中發(fā)揮重要作用[9,12]。巨噬細胞通?？煞譃?種基本類型:M1和M2巨噬細胞。M2巨噬細胞又可進一步分為M2a、M2b和M2c 3種類型[3,17]。M1巨噬細胞為促炎性巨噬細胞,它可分泌多種促炎細胞因子(如IFN-γ、TNF-α和IL-6等),清除壞死肌纖維及細胞碎片等,促進機體炎癥反應[18]。M2巨噬細胞為抗炎性巨噬細胞,可分泌多種肌再生因子(如IGF、MGF和HGF等)及抗炎細胞因子(IL-10),促進骨骼肌損傷修復[19]。巨噬細胞在損傷骨骼肌中的表達存在一定規(guī)律性,如Tonkin等[20]發(fā)現(xiàn),小鼠脛骨前肌注射心臟毒素損傷后第2天M1巨噬細胞達峰值,隨后表達下降,而M2巨噬細胞在傷后第5天達峰值。Shono等[21]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌擠壓損傷后1～4 d M1型巨噬細胞表達顯著增加,M2巨噬細胞在傷后7～10 d表達顯著增加。與上述損傷模型相似,本文發(fā)現(xiàn),M1巨噬細胞在骨骼肌挫傷后1～5 d顯著增加(P<0.01),M2a巨噬細胞在挫傷后5～10 d顯著增加,M2c巨噬細胞在挫傷后第10天顯著增加。此外,本實驗結(jié)果與上述研究者略有差異的原因可能與骨骼肌損傷方式不同(心臟毒素致傷與骨骼肌挫傷;擠壓致傷與骨骼肌挫傷)及損傷肌肉類型(脛骨前肌與腓腸肌)不同有關。盡管不同研究之間略有差異,但這些結(jié)果提示,骨骼肌損傷后巨噬細胞浸潤存在一定規(guī)律性,在骨骼肌損傷早期M1巨噬細胞浸潤占優(yōu)勢,隨后M1巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M2巨噬細胞,在損傷后期M2巨噬細胞顯著增多[22]。

3.3 骨骼肌挫傷后修復過程中巨噬細胞趨化的可能機制MCP-1/CCR2軸參與了多種病理環(huán)境中巨噬細胞的遷移,如腫瘤組織中MCP-1與CCR2結(jié)合可促進巨噬細胞趨化[23-24],離體狀態(tài)下MCP-1可促進經(jīng)典激活型巨噬細胞(M1巨噬細胞)的遷移與激活[25]。骨骼肌挫傷后,MCP-1/CCR2軸是否參與了巨噬細胞的募集則不得而知。本文通過RT-PCR檢測挫傷骨骼肌修復過程中巨噬細胞和趨化因子的表達,采用相關性分析探討骨骼肌損傷修復過程中巨噬細胞趨化的可能機制。結(jié)果顯示,骨骼肌挫傷后MCP-1表達顯著上調(diào),且與CCR2呈強相關(r=0.617,P=0.015),與M1巨噬細胞標志物CD68呈強相關(r=0.654,P=0.001),提示骨骼肌挫傷后MCP-1/CCR2軸可能參與了巨噬細胞的募集。

這一推測可從其他骨骼肌損傷模型得到支持。如Shireman等[6]發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,MCP-1基因缺失小鼠,在骨骼肌缺血性損傷后第3天巨噬細胞浸潤減少,在傷后第7天仍有巨噬細胞浸潤和大量壞死組織,損害了骨骼肌再生。與野生型小鼠相比,CCR2(MCP-1的受體)基因敲除小鼠,在心臟毒素注射骨骼肌損傷后巨噬細胞募集減少、脂肪沉積增加、VEGF表達下降,骨骼肌再生受損[5,26-27]。雖然MCP-1與M1巨噬細胞顯著相關,但MCP-1與M2巨噬細胞標志物CD163和CD206均無相關,提示MCP-1可能未參與M2巨噬細胞趨化,因為骨骼肌損傷后,M2巨噬細胞一般較晚出現(xiàn),且一般認為其由M1巨噬細胞轉(zhuǎn)化而來,而非從外周血募集[17,28]。以上結(jié)果提示,MCP-1/CCR2軸可能參與了挫傷骨骼肌修復過程中M1巨噬細胞的趨化。

此外,SDF-1/CXCR4軸也與巨噬細胞的遷移相關。SDF-1及其受體CXCR4屬于CXC趨化因子家族,在多種細胞中表達(如C2C12成肌細胞、肌衛(wèi)星細胞、造血干細胞、白細胞等)[29-31]。SDF-1/CXCR4軸常被認為與腫瘤環(huán)境中巨噬細胞募集有關[32-33]。雖然在離體狀態(tài)下SDF-1可促進巨噬細胞趨化[33],但能否促進損傷骨骼肌中巨噬細胞的募集則少有研究。本實驗中,骨骼肌挫傷后SDF-1 mRNA表達顯著上調(diào),且SDF-1與其受體CXCR4呈相關,但SDF-1與巨噬細胞3種標志物間均無相關性。提示在骨骼肌挫傷這一特定病理環(huán)境中,SDF-1/CXCR4可能并未參與巨噬細胞趨化。

4 結(jié)束語

本文基于前期大量文獻報道,僅對涉及巨噬細胞趨化的2條重要趨化途徑進行了探索。從結(jié)果看,MCP-1/CCR2軸可能參與了挫傷骨骼肌修復過程中M1巨噬細胞的趨化,但仍不能排除有其他促進巨噬細胞向損傷骨骼肌趨化的途徑。