楊 璞，邵 莉，王 錦，黃衛(wèi)華

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普通外科，長沙 410008；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，長沙 410208；3中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，長沙 410008

結(jié)腸癌是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病，目前結(jié)腸癌臨床主要依靠手術(shù)治療并且通過藥物化療控制腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，至今尚無專屬特效治療藥物[1,2]。由于富含結(jié)構(gòu)新穎，藥理活性獨特和類藥性的特征，天然產(chǎn)物是活性先導(dǎo)化合物和新藥研發(fā)的重要來源，在抗腫瘤化療藥物方面，許多藥物直接來源于天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化物或受天然產(chǎn)物啟發(fā)而設(shè)計合成的衍生物[3,4]。其中代表性的天然化合物有紫杉醇、長春花堿、喜樹堿、鬼臼毒素衍生物等。因此，從傳統(tǒng)的植物藥中尋找高效低毒的先導(dǎo)化合物來篩選抗結(jié)腸癌藥物是目前較為熱門的研究領(lǐng)域。

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)為刺人參屬植物，其藥用功效可用于糖尿病、風(fēng)濕病、高血壓、調(diào)節(jié)免疫和腫瘤防治等，具有抗氧化、抗菌、解熱鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血壓、抗腫瘤細胞增殖等生理活性[5,6]。刺人參根主要含揮發(fā)油、苯丙素、木脂素、炔醇類等化合物[7,8]。Falcarindiol (FAD)是東北刺人參中一種高含量炔醇化合物[9]，對人結(jié)腸癌細胞HCT-116具有很強細胞毒活性[10]，同時還具有抗氧化、抗菌、清除自由基等活性[6,11]。經(jīng)常規(guī)色譜方法分離處理，F(xiàn)AD與其同系物oplopandiol (OPD)無法被分離開，制備液相色譜單次進樣制備運行時間為40分鐘，耗時長，有機溶劑消耗多[12]。

Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面較為重要的一條信號通路[13]。當(dāng)Wnt信號被激活后，β-catenin的磷酸化降解被抑制，使得β-catenin在細胞內(nèi)過度聚積后入核與TCF/LEF(T細胞因子/淋巴增強因子)結(jié)合后啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，而c-myc及cyclinD1是β-catenin下游主要調(diào)控細胞增殖以及周期的兩個重要基因[14]。此前雖有報道稱東北刺人參中炔醇富集部位對Wnt信號通路中的β-catenin蛋白具有一定的抑制作用，但對于FAD單獨是否可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展目前尚無研究報道。

本研究對以往的FAD分離制備方法進行優(yōu)化，采用重疊進樣的方法，可以更加快速高效的方制備FAD單體。此外，本文檢測了FAD對HCT-116細胞增殖的影響并評價其對周期相關(guān)基因β-catenin、cyclin D1、c-myc的調(diào)控作用，以期為FAD作為一種新的結(jié)直腸癌治療藥物開發(fā)提供相關(guān)研究依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與儀器

ABI/Sciex三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)API 4000質(zhì)譜儀；Bruker ACF-500型核磁共振儀。美國Agilent 1200系列分析液相色譜儀、日本島津LC-20A制備液相色譜系統(tǒng)。美國Phenomenex Luna C18(4.6 × 250 mm,5 μmoL/L)分析色譜柱。美國Phenomenex Luna C18(21.2 × 250 mm,5 μmoL/L)制備色譜柱。薄層色譜GF254硅膠、正相柱色譜硅膠(200～300 目，青島海洋化工廠)、40～60 μmoL/L反相硅膠(美國Grace Alltech公司)；色譜純甲醇和乙腈(德國Merck公司)；分析純試劑(國藥控股有限公司，中國)。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；AR1140 電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；FC 500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；美國Biotek Epoch酶標(biāo)儀；RT-qPCR儀(Roche 480，美國羅氏公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) (美國Bio-Rad 公司)。Falcon Labware 細胞培養(yǎng)瓶(美國Franklin Lakes)。0.25%胰酶細胞消化液(含0.02% EDTA)，McCoy’s 5A培養(yǎng)基以及磷酸鹽緩沖液(美國Mediatech公司)。β-actin，β-catenin，cyclin D1和c-myc引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)；β-catenin，cyclin D1和c-myc單克隆抗體及二抗抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；美國Sigma-Aldrich公司青霉素和鏈霉素。美國Promega的CellTiter 96細胞增殖MTS測定試劑盒。

1.2 藥材與試藥

藥材于2015年8月采自遼寧省本溪市桓仁滿族自治縣，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)竇德強教授鑒定為東北刺人參O.elatus的干燥根。憑證標(biāo)本(OER-20150826-1)存放于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所。5-FU采購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號：M0601A)。

1.3 細胞

人結(jié)腸癌細胞系HCT-116購自中南大學(xué)細胞中心，細胞保存于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所。細胞在5% CO2、37 ℃及飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和 50 IU雙抗的McCoy’s 5A，所有實驗均在細胞對數(shù)生長期進行。

2 方法

2.1 FAD分離制備

2.1.1 提取與粗分離

東北刺人參干燥根2.0 kg，粉碎過40目篩，95%甲醇冷浸提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏210 g，取190 g提取物分散于1 L蒸餾水中，分別用水飽和石油醚(1×3 L)萃取得浸膏19 g，水飽和乙酸乙酯(1×3 L)萃取得浸膏65 g，水飽和正丁醇(1×3 L)萃取得浸膏73 g及水部位。乙酸乙酯部位50 g上硅膠柱層析分離，經(jīng)二氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶100)梯度洗脫，二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脫物經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析和Sephadex LH-20 (氯仿-甲醇，1∶1)柱層析，所得組分含有FAD和其同系物OPD。

2.1.2 HPLC制備

將含F(xiàn)AD組分溶于甲醇(5 mg/mL)，采用美國Phenomenex Luna C18(21.2×250 mm,5 μmoL/L)制備色譜柱，以甲醇-水(78∶22)為流動相，流速為10 mL/min，每次進樣200 μL，檢測波長為203 nm，采用重疊進樣，充分利用空白保留時間，縮短樣品制備時間，最終制備得高純度FAD (6.8 g)和OPD (5.1 g)(純度均 ≥ 98%)。

2.2 MTS法檢測細胞增殖

HCT-116細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底部面積90%以上，用0.25%胰酶消化液消化，傳代。對數(shù)生長期細胞轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，每個培養(yǎng)孔中含5 × 104個細胞，相同條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時，給藥組中加入不同濃度的FAD稀釋液(培養(yǎng)體系終濃度為100、50、30、10、5、2、1 μmoL/L)，每個試藥濃度設(shè)3個平行復(fù)孔；對照組加入與給藥組等體積的培養(yǎng)基。置相同條件下培養(yǎng)。48小時后棄培養(yǎng)液，每孔加入用培養(yǎng)基配置的MTS溶液100 μL(333 μg/mL)，置培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔吸取60 μL至另一96孔板用于酶標(biāo)儀檢測，檢測波長為490 nm條件下測定吸光度(A)值，以培養(yǎng)基中加入相同濃度DMSO處理的細胞為對照組，重復(fù)檢測3次，取平均值為最終結(jié)果計算FAD對細胞的增殖抑制率，利用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計半數(shù)抑制濃度IC50；增殖抑制率=(A對照-A藥物)/(A對照-A空白)。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取對數(shù)生長期HCT-116細胞，棄去培養(yǎng)液，分別用2 mL PBS溶液清洗2次，加入0.5 mL 0.25%胰酶細胞消化液后置于培養(yǎng)箱中消化2 min，而后加入2 mL細胞完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打使細胞充分消化均勻分散，將細胞懸液轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，1 300 rpm離心5 min，棄上清液。重新加入2 mL培養(yǎng)液重懸沉淀細胞，細胞單層接種在12孔板中(細胞數(shù)為1 × 105個/孔)培養(yǎng)12 h，以不同濃度(2、5、10 μmoL/L)的FAD作用于HCT-116細胞，設(shè)3個平行復(fù)孔，并加入純培養(yǎng)基設(shè)為對照組。細胞培養(yǎng)48 h 后，加0.25%胰酶消化液消化，收集細胞，1 300 rpm離心5 min后以PBS清洗1次，用預(yù)冷的75%乙醇4 ℃固定2 h，加入0.25% Triton X-100冰浴5 min。然后1 300 rpm離心5 min，用冷PBS洗滌細胞1次；用300 μL PI (40 μg/mL，含0.1 mg/mL RNase)染色，輕輕混勻后常溫避光孵育25 min，使用流式細胞儀檢測熒光信號，每次至少檢測2×104個細胞。

2.4 RT-qPCR檢測周期阻滯相關(guān)基因

不同濃度(0、2、5、10 μmoL/L) FAD作用于HCT-116細胞48 h后，收獲HCT-116細胞，利用Trizol試劑盒常規(guī)提取細胞總RNA，用Nano drop 2000檢測RNA純度和完整性。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成cDNA。Q-PCR的反應(yīng)程序：所有條帶(β-actin、β-catenin、cyclin D1和c-Myc)的條件選擇為95 ℃、10 min；95 ℃、15 sec，60 ℃、30 sec共40個循環(huán)；95 ℃、15 sec，60 ℃、1 min，95 ℃、15 sec。β-actin的mRNA擴增為內(nèi)參照。各基因的擴增引物如下：人源β-catenin(前引：5′-CATCTACACAGTTTGATGCTGCT-3′，后引：5′-GCAGTTTTGTCAGTTCAGGGA-3′)；人源cyclin D1(前引：5′-GCTGCGAAGTGGAAAC CATC-3′，后引：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′)；人源c-myc(前引：5′-GTCAAGA GGCGAACACACAAC-3′，后引：5′-TTGGACGGACAGGATGTATGC-3′)；人源β-actin(5′-TGACTGACTACCTCATGAAGAT-3′，5′-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTT-3′)。

2.5 Western blotting檢測β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表達

加入不同濃度(0、2、5、10 μmoL/L)的FAD作用于HCT-116細胞，24 h后收集細胞及培養(yǎng)液，離心棄去上清，細胞沉淀用預(yù)冷PBS清洗2次，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min (每8分鐘重懸混勻1次)，13 000 rpm 離心20 min，取上清，BCA法測定總蛋白含量，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，蛋白封閉后，封一抗過夜，加入二抗2 h后曝光顯影。最后，使用Image J對蛋白條帶的灰度值進行相對定量分析。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 FAD快速制備

經(jīng)常規(guī)色譜分離，薄層色譜紫外觀察及顯色顯示FAD和其同系物OPD無法被分離，OPD結(jié)構(gòu)鑒定為二氫FAD；因此，采用高效液相色譜對其分離制備，如圖1(A)所示，F(xiàn)AD (tR= 36.7 min)與OPD (tR= 38.5 min)單次完成制備分離需運行40 min，其中保留時間tR= 2.1 min的色譜峰為溶解樣品的甲醇溶劑峰，單次樣品制備的tblank= 36.1 min。

如果按圖1(A)所示方法制備FAD，則耗時長，有機溶劑消耗多。圖1(B)所示，充分利用樣品運行的空白保留時間，采用重疊多次進樣操作程序，把FAD和oplopandiol (OPD)保留時間差加上他們的半峰寬設(shè)為tf→o= 3.5 min，兩次進樣制備的時間差Δt=tblank/n (1tf→o最大自然數(shù))，為了保障樣品純度，本次樣品制備取Δt= 4.5 min (n=8)。

圖1 FAD制備色譜圖Fig.1 The preparative chromatogram of FAD注：單次進樣完整運行制備色譜圖(A)；重疊進樣制備色譜圖(B)。Note:The preparative chromatogram of FAD with single injection (A);The preparative chromatogram of FAD with multiple injections (B).

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

Falcarindiol 淡黃色油狀物；1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH5.94(1H,ddd,J= 17.5,10.0,5.9 Hz,H-2),5.64(1H,dd,J= 17.5,1.5 Hz,H-1b),5.51(1H,ddt,J= 11.5,5.0,1.5 Hz,H-9),5.47(1H,ddt,J= 11.5,7.5,1.0 Hz,H-10),5.28(1H,d,J= 10.0 Hz,H-1a),5.21(1H,d,J= 8.5 Hz,H-8),4.95(1H,brd,J= 5.0 Hz,H-3),2.11(2H,q,J= 7.0,H-11),1.39(2H,m,H-12),1.29(8H,m,H-13,H-14,H-15,H-16),0.88(3H,t,J= 7.0,H-17);13C NMR(125 MHz,CDCl3):δc 117.4(C-1),135.9(C-2),63.4(C-3),78.4(C-4),70.3(C-5),68.6(C-6),79.8(C-7),58.5(C-8),134.5(C-9),127.7(C10),27.7(C-11),29.1(C-12),29.3(C-13),29.2(C-14),22.6(C-15),31.7(C-16),14.1(C-17)；ESI-MS：m/z261 [M+H]+(C17H24O2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，鑒定化合物為falcarindiol。

Oplopandiol 黃色油狀物；1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH5.59(1H,ddt,J= 11.0,7.5,1.0 Hz,H-9),5.52(1H,t,J= 8.5 Hz,H-10),5.20(1H,d,J= 8.5 Hz,H-8),4.39(1H,t,J= 6.5 Hz,H-3),2.09(2H,q,J= 7.0 Hz,H-11),1.74(2H,m,H-2),1.39(2H,m,H-12),1.29(8H,m,H-13,H-14,H-15,H-16),1.01(3H,t,J= 7.5 Hz,H-1),0.89(3H,t,J= 7.0 Hz,H-17);13C NMR(125 MHz,CDCl3):δc 9.4(C-1),30.6(C-2),63.9(C-3),79.2(C-4),68.9(C-5),68.8(C-6),80.8(C-7),58.5(C-8),134.5(C-9),127.9(C-10),27.8(C-11),29.1(C-12),29.4(C-13),29.2(C-14),22.6(C-15),31.8(C-16),14.1(C-17)；ESI-MS：m/z285 [M+Na]+(C17H26O2)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對照基本一致，確定化合物2為oplopandiol。

3.3 細胞毒活性

FAD對p53基因野生型結(jié)腸癌細胞HCT-116具有較強的細胞毒活性且呈現(xiàn)一定的時效量效關(guān)系，其與HCT-116細胞作用24、48、72 h的IC50值分別為8.1±1.4，4.6±0.5和3.2±0.4 μmoL/L，且抑制作用強于陽性對照藥5-氟尿嘧啶。FAD對腫瘤細胞與正常細胞毒性作用未顯良好的選擇性，對人正常肝細胞(LO2)和血管內(nèi)皮細胞(HVEC)均顯示一定的細胞毒活性，與HCT-116細胞作用24 h的IC50值分別為20.5±2.6 和18.7±1.5 μmoL/L。與正常細胞相比，F(xiàn)AD對癌細胞表現(xiàn)出更強的細胞增殖抑制作用。

3.4 細胞周期影響

FAD作用于HCT-116細胞48 h后，對其細胞周期阻滯現(xiàn)象比較明顯(見圖2)。經(jīng)2 μmoL/L 的FAD作用48 h后，HCT-116細胞周期被阻滯在G2/M期比率為23.5%±1.2%。隨著給藥濃度的增加，HCT-116細胞周期被阻滯在G2/M期比率由23.5%±1.2%上升至38.6%±1.8%，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖2 流式細胞術(shù)分析FAD對HCT-116細胞周期影響Fig.2 Effects of FAD on cell cycle analysis of HCT-116 using flow cytometery

3.5 周期相關(guān)基因mRNA水平的影響

不同濃度的FAD (2、5、10 μmoL/L)作用于結(jié)腸癌細胞HCT-116 48 h后，細胞中c-myc、β-catenin、cyclin D1基因的表達下調(diào)，且隨著試藥濃度的增加，下調(diào)作用增強，具體結(jié)果見圖3。

圖3 FAD對HCT-116細胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc mRNA表達的影響Fig.3 Effects of FAD on mRNA level of β-catenin、 cyclin D1 and c-myc in HCT-116 cell line

3.6 周期相關(guān)蛋白表達的影響

與未處理組細胞相比，不同濃度的FAD (2、5、10 μmoL/L)作用于結(jié)腸癌細胞HCT-116 48 h后，細胞中β-catenin蛋白明顯被抑制。同時，β-catenin下游的蛋白cyclin D1和c-myc的表達也呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，且隨著試藥濃度的增加，下調(diào)作用增強，具體結(jié)果見圖4。

4 討論

天然藥物在中醫(yī)理論指導(dǎo)下用藥稱之為中藥或中草藥，源于天然藥物的天然產(chǎn)物是藥用植物自然進化選擇形成的次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)具有化學(xué)多樣性、活性多樣性和類藥性。臨床上應(yīng)用的許多藥物都直接或間接來源于天然產(chǎn)物[15]，從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用的藥物是其有效途徑之一。高純度天然化合物的獲取是天然藥物開發(fā)研究的基礎(chǔ)，多數(shù)天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)類似的異構(gòu)體或者同系物，對于結(jié)構(gòu)差異較小的異構(gòu)體或者同系物，常規(guī)色譜分離技術(shù)很難將其完全分離，制備高效液相色譜是將他們完全分離純化有效手段之一，優(yōu)化制備方法，將有助于天然產(chǎn)物快速高效制備，節(jié)省有機溶劑使用，降低環(huán)境污染。本課題以FAD為研究為例，采用重疊進樣，所建立的方法高效、穩(wěn)定、快速，極大的縮短了樣品制備時間。

圖4 FAD對HCT-116細胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表達的影響Fig.4 Effects of FAD on protein expression of β-catenin、cyclin D1 and c-myc in HCT-116 cell line

細胞內(nèi)外信號配合調(diào)控細胞周期，如果胞內(nèi)外信號不能很好配合，細胞將不能從一個分裂期進入下一個分裂期，這種現(xiàn)象稱為細胞周期阻滯。細胞周期阻滯有助于細胞維持自身基因的穩(wěn)定性，其調(diào)控的基因突變可明顯影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。細胞周期阻滯為細胞提供額外的時間用于修復(fù)損傷，從而減少突變的進一步發(fā)生，避免腫瘤惡化與發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)可以抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116的增殖及阻滯其細胞周期[16,17]，但其周期阻滯的相關(guān)基因的表達并未被闡明，本研究發(fā)現(xiàn)其可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白的表達，進而下調(diào)cyclin D1和c-myc蛋白表達。研究結(jié)果表明，不同濃度的FAD (2、5、10 μmoL/L) 作用于結(jié)腸癌細胞HCT-116 48 h后，可明顯下調(diào)β-catenin蛋白及其下游蛋白cyclinD1和c-myc的表達，從而使腫瘤細胞周期被阻滯和增殖被抑制。

東北刺人參葉中主要含有皂苷類成分，而其根和莖中主要含有苯丙素、木脂素及炔醇類成分[18,19]，其中炔醇是其抗結(jié)腸癌活性的藥效成分。FAD是首次從刺人參屬中發(fā)現(xiàn)具有(3S,8S)-立體結(jié)構(gòu)的炔醇，而從傘形科植物中發(fā)現(xiàn)的主要是(3R,8S)-FAD，而后者抗腫瘤活性未見相關(guān)報道。本研究建立東北刺人參FAD快速高效的制備HPLC純化方法。并探討其結(jié)腸癌細胞HCT-116具有細胞毒活性作用機制，F(xiàn)AD對結(jié)腸癌細胞HCT-116具有較強的細胞毒活性，且能對其細胞周期產(chǎn)生阻滯作用，其機制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。