單梅華，董建新，劉曉光，馬雅慧，王金梅，朱毓永，李 潔

河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)系，承德 067000

乳腺癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位列女性癌癥榜首，每年約52.2萬人死于乳腺癌，且近十幾年來居民發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1，2]。目前乳腺癌的治療包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放療化療以及分子靶向治療[3]。盡管治療乳腺癌的手段有了很大提高，但治療方法仍會對人體造成較大的損傷，天然產(chǎn)物的治療療效顯著且副作用小，在臨床中逐漸得到廣泛的應(yīng)用。

山杏是薔薇科杏屬植物，其杏果具有良好的醫(yī)療保健作用，主治風(fēng)寒肺病生津止渴、潤肺化痰、清熱解毒；山杏仁蛋白可抑制人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其死亡[4]，其蛋白酶水解物能夠顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖[5]；苦杏仁苷也有一定的抗癌活性[6]。據(jù)實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，山杏葉中含有豐富的總?cè)扑?、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸[7]，提示其具有潛在的抗癌價值。本實驗采用山杏葉乙酸乙酯提取物處理人乳腺癌細(xì)胞MCF7，觀察其對該細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，并通過對活性氧ROS和相關(guān)基因表達(dá)的檢測來探討其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)山杏葉的抗癌效果提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

人乳腺癌細(xì)胞系MCF7購自北京嘉美臻元生物技術(shù)有限公司，由本實驗室培養(yǎng)。

1.1.2 實驗藥物與試劑

山杏葉采自河北民族師范學(xué)院標(biāo)本園，山杏葉乙酸乙酯提取物由本校生物資源開發(fā)實驗室提取，并用DMSO配制為1 g/mL的儲存液。胎牛血清(美國Gibco公司，批號：42F0266K)； DMEM(美國Gibco公司，批號：8118387)；胰蛋白酶(以色列BI公司，批號：0032018)；青霉素-鏈霉素(以色列BI公司，批號：1831739)；二甲基亞砜DMSO(碧云天，批號：1213C0343)；CCK8試劑盒(碧云天，批號：C0042)；活性氧檢測試劑盒(碧云天，批號：S0033)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京嘉美，批號：LHK601-100)；第一鏈cDNA合成試劑盒(北京全式金，批號：7E281I8)；GelRed核酸染料(Biotium，批號：18G00924)；引物(上海生工)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，批號：P0006C)；caspase3活性測定試劑盒(索萊寶，批號：BC3830)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

完全培養(yǎng)基由含10%胎牛血清FBS+1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基組成，人乳腺癌細(xì)胞MCF7接種于完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3天，待細(xì)胞密度為80%～90%時用胰酶進(jìn)行傳代消化培養(yǎng)。山杏葉乙酸乙酯提取物浸膏用DMSO配制為1 g/mL母液后，再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別稀釋成0.125、0.5、2 mg/mL的濃度處理MCF7細(xì)胞，36 h后，收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK8法檢測山杏葉乙酸乙酯提取物對乳腺癌MCF7細(xì)胞的增殖影響

取對數(shù)期生長的MCF7細(xì)胞，約1×104/孔接種于96孔板，24 h貼壁后，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入含提取物濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL的培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)36、48 h后，吸出培養(yǎng)基，加入含10% CCK8溶液的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度，計算不同濃度下MCF7細(xì)胞的存活率以及36、48 h的細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)。

細(xì)胞存活率(%)=(OD實驗組- OD空白組)/

(OD對照組- OD空白組)×100%

1.2.3 流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞凋亡的影響

按每孔3×105個細(xì)胞將MCF7細(xì)胞接種到六孔板中，培養(yǎng)過夜后加入提取物，設(shè)置為三組濃度(0、0.5、2 mg/mL)，作用36 h后收集細(xì)胞。PBS洗滌一次，用Annexin V-FITC標(biāo)記，避光孵育15 min。上機(jī)前5 min加入PI染色，取細(xì)胞懸液做流式檢測。FITC激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm；PI激發(fā)波長為535 nm，發(fā)射波長為615 nm。實驗重復(fù)三次。

1.2.4 乳腺癌MCF7細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS水平檢測

在六孔板中加入每孔3×105個對數(shù)生長的MCF7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別加入0、0.5、2 mg/mL提取物濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，之后利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧ROS的檢測。每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌三次，倒置熒光顯微鏡下通過熒光強(qiáng)度來測定ROS水平?；?qū)⒓?xì)胞消化下來，懸浮于終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA溶液中，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，洗滌三次。流式細(xì)胞儀檢測ROS含量，激發(fā)波長為502 nm，發(fā)射波長為530 nm，并用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗重復(fù)三次。

1.2.5 RT-PCR檢測CDK4、Cyclin D1、Cyclin E、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平

實驗分為對照組、山杏葉乙酸乙酯提取物處理組(0.125、0.5、2 mg/mL)。將MCF7按每孔1×105個細(xì)胞接種到24孔板中，提取物處理36 h后按照Trizol試劑盒方法裂解細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再加入相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用Image J軟件對電泳條帶灰度分析。實驗重復(fù)三次。內(nèi)參為β-actin，目的基因為CDK4、Cyclin D1、Cyclin E、Bax、Bcl-2，引物序列見表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequence and product length

1.2.6 caspase-3活性的檢測

六孔板中每孔接種3×105個MCF7細(xì)胞，按0、0.125、0.5、2 mg/mL提取物濃度進(jìn)行分組，培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞用適量裂解液提取蛋白，并測定蛋白濃度。每組吸取25 μL樣品置于96孔板中，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，孵育6 h后用酶標(biāo)儀檢測OD405 nm的吸光度。利用公式計算caspase-3的相對活性： OD實驗組/ OD對照組×100%。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，顯著性水準(zhǔn)P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 山杏葉乙酸乙酯提取物抑制MCF7細(xì)胞增殖

采用CCK8法檢測不同濃度的山杏葉乙酸乙酯提取物處理36 h、48 h后，乳腺癌MCF7細(xì)胞的存活率變化。結(jié)果如表2所示， 0.125 mg/mL濃度處理組與對照組相比，抑制效果不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在濃度為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL時，提取物對MCF7細(xì)胞有明顯的抑制作用，細(xì)胞存活率隨時間和濃度的增加而逐漸降低，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。山杏葉乙酸乙酯提取物作用MCF7細(xì)胞36 h時，IC50為1.236 mg/mL，48 h的IC50為0.313 mg/mL。

2.2 山杏葉乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡的發(fā)生

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，濃度為0.5 mg/mL和2 mg/mL的山杏葉乙酸乙酯提取物作用36 h后，MCF7細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞平均所占比例為52.2%和58.6%， 較對照組的1.2%均有顯著地提高(P<0.05)，且具有一定的濃度依賴性(見圖1)。

表2 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7 細(xì)胞增殖的抑制作用Table 2 Inhibition effect of ethyl acetate extract of wild apricot leaves on the proliferation of MCF7

注：*P<0.05，與對照組比較；△P<0.05，與同組內(nèi)36h比較。

Note:*P<0.05,compared with control;△P<0.05,compared with the 36h data in the same group.

2.3 山杏葉乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

用濃度為0.5 mg/mL和2 mg/mL的提取物處理MCF7細(xì)胞36 h后，利用DCFH-DA作為熒光探針來檢測胞內(nèi)活性氧水平的變化。圖2熒光顯微鏡結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中的ROS含量顯著高于對照組，且隨提取物濃度的增加而增加。同時，我們使用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)檢測了ROS變化，得到了同樣的結(jié)論。這些都證明山杏葉乙酸乙酯提取物可以誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞ROS水平的提升。

2.4 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用RT-PCR檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK4、Cyclin E和Cyclin D1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，0.125、0.5、2 mg/mL提取物處理組均能顯著下調(diào)MCF7細(xì)胞中CDK4、Cyclin E和Cyclin D1基因的表達(dá)(P<0.05)，且有明顯的濃度依賴性(見圖3)。

2.5 山杏葉乙酸乙酯提取物調(diào)節(jié)MCF7細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

不同濃度山杏葉乙酸乙酯提取物(0、0.125、0.5、2 mg/mL)處理MCF7細(xì)胞36 h后，RT-PCR檢測顯示，與對照組相比，提取物的處理可以上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)，且具有一定的濃度依賴性(見圖4)。

圖1 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of ethyl acetate extract of wild apricot leaves on the apoptosis of MCF7 cells

圖2 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響Fig.2 Effect of ROS in MCF7 cells of ethyl acetate extract of wild apricot leaves

2.6 山杏葉乙酸乙酯提取物對caspase-3活性的影響

如圖5所示，山杏葉乙酸乙酯提取物作用于MCF7細(xì)胞24 h后，實驗組細(xì)胞的caspase-3活性與對照組相比明顯增強(qiáng)(P<0.05)。藥物濃度越高，活性也越強(qiáng)。提示山杏葉乙酸乙酯提取物可以通過調(diào)控caspase-3的活性來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

3 結(jié)論

三萜酸化合物是分布廣泛的天然產(chǎn)物，其抗腫瘤活性近年來受到越來越多的關(guān)注。研究報道，無論在體內(nèi)還是體外，三萜酸化合物均能通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤的作用[8]。

圖3 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞中CDK4、Cyclin E和Cyclin D1 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Expression of CDK4,Cyclin E and Cyclin D1 mRNA of MCF7 cells in the effect of ethyl acetate extract of wild apricot leaves

圖4 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7細(xì)胞中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA of MCF7 cells in the effect of ethyl acetate extract of wild apricot leaves

圖5 山杏葉乙酸乙酯提取物對MCF7 細(xì)胞中caspase-3活性的影響Fig.5 Relative activity of caspase-3 in the effect of ethyl acetate extract of wild apricot leaves

山杏葉中含有豐富的總?cè)扑?、樺木酸、齊墩果酸和熊果酸。本實驗采用CCK8法證明，山杏葉乙酸乙酯提取物具有抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖、降低細(xì)胞存活率的作用，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

有文獻(xiàn)表明，三萜酸化合物可以通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程來干涉腫瘤細(xì)胞的正常增殖，從而誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡[9]。在細(xì)胞周期開始時，Cyclin D1首先被合成，并與CDK4組成CDK4/Cyclin D1復(fù)合體幫助細(xì)胞通過G1檢驗點，促使細(xì)胞分裂由G1期向S期過渡[10,11]。據(jù)報道，雙氫青蒿素聯(lián)合吉非替尼可以通過降低CyclinD1和CDK4的表達(dá)來造成周期阻滯[12]。本研究中，Cyclin D1、CDK4的表達(dá)量在藥物處理后均有了明顯下調(diào)，預(yù)示山杏葉乙酸乙酯提取物可能會抑制MCF7細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而使細(xì)胞停留在G1期。另外，Cyclin E在細(xì)胞周期G1的晚期可以與CDK2形成復(fù)合體來調(diào)控G1/S期的轉(zhuǎn)化[13]。在我們的實驗中，Cyclin E的表達(dá)隨藥物濃度的增大也發(fā)生了顯著性降低。綜上，我們可以推測山杏葉乙酸乙酯提取物可以通過調(diào)控G1/S期基因Cyclin D1、CDK4和Cyclin E的表達(dá)來抑制MCF7細(xì)胞周期的正常運行。

Bcl-2家族作為caspase的上游基因，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其中，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax則是促凋亡基因。Bcl-2和Bax比例的調(diào)節(jié)起到了對細(xì)胞凋亡的指示作用[14,15]。研究表明，抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[16,17]。本實驗結(jié)果顯示，MCF7細(xì)胞在山杏葉乙酸乙酯提取物處理后，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而增加。并且，Bcl-2的mRNA水平明顯降低，Bax則明顯增高。caspase-3是Bcl-2和Bax的下游基因，也是細(xì)胞凋亡過程中最主要的效應(yīng)者，抑制caspase-3的切割活化可有效抑制凋亡的發(fā)生[18]。本論文通過對caspase-3活性的檢測，證實山杏葉乙酸乙酯提取物可以下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，從而增強(qiáng)caspase-3的活性，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

活性氧ROS是一種特殊的信號分子，作為第二信使參與細(xì)胞的多種信號傳導(dǎo)過程。它在凋亡的線粒體途徑中，通過改變線粒體的膜通透性、降低線粒體膜電位來促進(jìn)Cyt-c的釋放，引發(fā)caspase家族的酶活性級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。有研究表明，一種三萜類化合物3-O-acetyl-11-keto-β-boswellic acid可以通過提升肝癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，上調(diào)Bax表達(dá)和下調(diào)Bcl-2表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。本文分別通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞ROS水平的變化，發(fā)現(xiàn)藥物的刺激可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，這說明山杏葉乙酸乙酯提取物可以通過提升ROS水平來促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜合以上實驗結(jié)果，山杏葉提取物可以抑制細(xì)胞增殖，通過抑制CDK4、Cyclin E和Cyclin D1的表達(dá)而阻滯細(xì)胞周期的運行。另外，提取物通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax，增強(qiáng)caspase-3活性，并促進(jìn)活性氧ROS的釋放來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。