鄭雪萍，伏園園，夏 凡，顧 瓊，李 民

中山大學藥學院，廣州 510006

自噬是真核細胞內(nèi)通過自噬溶酶體降解受損細胞器及大分子物質等廢物并將其代謝回收利用的一種自我調節(jié)及保護機制，可視作胞內(nèi)的“回收工廠”[1,2]。自噬是一個動態(tài)的過程，主要分為自噬泡的形成、自噬體膜的延伸和成熟、自噬溶酶體的形成等幾個階段[3]。自噬的發(fā)生發(fā)展需要許多自噬相關蛋白(autophagy related proteins,ATGs)的參與，其中包括由ATG12-ATG5-ATG16復合體和LC3-PE介導的兩條泛素樣通路，其主要參與自噬體的形成與成熟，是自噬過程中至關重要的一步[4]。胞漿中的LC3前體首先需要被半胱氨酸蛋白酶ATG4B在其保守的C端120位精氨酸酶切暴露甘氨酸殘基，成為LC3-I，LC3-I經(jīng)過一系列自噬蛋白的傳遞及活化，最后在ATG12-ATG5-ATG16復合體的作用下與PE共價結合形成膜結合形式的LC3-II，從而參與自噬體雙層膜的延伸。最后，ATG4B又能發(fā)揮去脂化活性，將LC3-I從膜上解離得以循環(huán)利用[5,6]。因此，ATG4B功能的變化對自噬過程的調控具有重要的影響。

自噬作為一種防御機制，既可通過切斷營養(yǎng)來源控制腫瘤細胞的增殖，又可作為保護機制被腫瘤細胞啟動從而抵御外界刺激，可見自噬與腫瘤存在密不可分的聯(lián)系。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤的生長過程中或是某些病理條件下都觀察到ATG4B的高表達，說明ATG4B對腫瘤的發(fā)展可能起著重要的作用。有報道指出ATG4B活性位點的突變導致的自噬抑制也同時抑制了小鼠胰腺導管腺癌細胞的增殖[7]。Akin等[8]篩選出的ATG4B抑制劑NSC185058對骨肉瘤細胞有顯著的抑制作用。此外，本實驗室前期利用虛擬篩選等方法篩選出的新型ATG4B抑制劑S130不僅對ATG4B有明顯的抑制作用，同時也具有一定的抗腫瘤活性[9]。因此，尋找篩選更多抑制效價高，特異性強的ATG4B抑制劑，對于開發(fā)以ATG4B為靶標的治療手段具有重要的意義。

目前越來越多的科學家致力于在天然產(chǎn)物中提取抗腫瘤活性成分，開發(fā)天然的抗腫瘤藥物。有報告表明，在1981至2014年間推出的1562個小分子藥物中，有65.0%來源于天然產(chǎn)物，而其中抗腫瘤藥物所占比例高達83.0%[10,11]。而且我國擁有非常豐富的天然產(chǎn)物資源，因此利用得天獨厚的條件，尋找開發(fā)具有臨床應用價值的天然活性化合物具有非常廣闊的前景。三白草Saururuschinensis(Lour.)Baill屬三白草科植物，是我國的一種傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒、利尿消腫的作用。有研究發(fā)現(xiàn)三白草的提取物三白草酮具有抗腫瘤活性，因此受到越來越多的關注[12]。XGN56和XGN59是從三白草中提取出的雙木脂素類天然產(chǎn)物，兩者的結構非常相似，僅在側鏈構型及苯環(huán)取代基上有所不同[13]。已有文獻報道XGN59(三白脂素8)能夠顯著抑制在人乳腺癌細胞中高表達的缺氧誘導因子HIF-1，導致癌細胞在微氧環(huán)境中適應能力下降，生長抑制，可見該化合物具備一定的臨床應用價值[14]。我們在前期篩選中發(fā)現(xiàn)兩種化合物與ATG4B晶體結構均有較好的對接作用，同時結合本實驗室建立的ATG4家族活性化合物篩選的方法學，驗證了XGN56和XGN59對ATG4B功能的作用，為后續(xù)應用于疾病臨床治療及ATG4B抑制劑的篩選提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞

GFP-LC3 HeLa、GFP-LC3 WT-MEF及GFP-LC3ATG5-/--MEF穩(wěn)轉細胞為本實驗室保存。

1.2 藥物、試劑與儀器

XGN56和XGN59是從采自廣西的三白草Saururuschinensis(Lour.)Baill地上部分，經(jīng)95%乙醇提取，然后乙酸乙酯萃取，經(jīng)各種色譜技術分離純化得到；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(美國Merck公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基及類胎牛血清(美國Gibco)；巴弗洛霉素(Bafilomycin，Baf)(美國LC laboratories公司)；原核表達的ATG4B及底物FRET-GATE-16質粒均為本實驗室構建及保存；Ni-NTA 填料(北京韋氏博慧)；脫鹽柱PD-10(美國GE公司)；分子對接軟件Accelrys Discovery Studio 2.5.5(SanDiego，CA，USA)；三維結構對接顯示軟件PyMoL(DeLano Scientific，Palo Alto，CA)；ATG4B(ID：2CY7)及ATG4B-LC3復合體(ID：2ZZP)晶體結構均來源于PDB數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；多功能酶標儀(美國BioTek公司)；熒光顯微鏡(美國Life technologies公司)。

1.3 分子對接

在PDB數(shù)據(jù)庫中，ATG4B的PDB ID為2CY7，ATG4B-LC3復合體的PDB ID為2ZZP，選擇這兩種晶體結構作為與化合物對接的受體。利用Accelrys Discovery Studio 2.5.5進行分子對接，并通過Consence Score對蛋白-化合物的對接效果進行打分，同時觀察其結合模式，決定是否適合用于后續(xù)的活性測定。

1.4 蛋白表達及純化

將His-ATG4B和FRET-GATE-16重組質粒分別轉入原核表達菌株BL21(DE3)，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h左右，按照1∶100擴增培養(yǎng)。當菌液OD600達到0.6左右時，加入0.5 mmol/L IPTG，220 rpm，16 ℃誘導培養(yǎng)16 h后收集菌體。菌體離心后，用預冷的PBS清洗2～3次，按照濕菌重：結合緩沖液=1∶5的比例加入緩沖液重懸菌體，95%的功率超聲破碎2 h。破碎后的菌體離心后，吸取上清與適量的Ni-NTA 填料4 ℃結合1 h，之后轉移至柱子中，用含200 mmol/L 咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，最后進行脫鹽超濾濃縮后加入20%甘油于-80 ℃保存。

1.5 FRET法檢測酶活性

在384黑板中將化合物以100 μmol/L 為起始終濃度倍比稀釋后與1.25 μg/mL 的ATG4B在37 ℃孵育30 min，然后加入50 μg/mL 的底物FRET-GATE-16，體系為50 μL，將板放入37 ℃酶標儀中反應30 min，測定反應結束時波長為527及477 nm 的熒光值?；衔飳TG4B抑制作用公式為：抑制率=(RFUmax-RFUcompound)/(RFUmax-RFUmin) 100%。(RFU：527/477；RFUmax：空白組；RFUcompound：化合物組；RFUmin：無化合物，只有酶和底物組)。

1.6 SDS-PAGE法檢測酶活性

1.5 μg/mL的ATG4B與梯度濃度的化合物在37 ℃孵育30 min，然后加入250 μg/mL的底物FRET-GATE-16，體系為20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育30 min。反應結束后加入上樣緩沖液，沸水煮5 min后上樣電泳，結束后考馬斯亮藍染色分析。

1.7 GFP-LC3熒光實驗

穩(wěn)定表達GFP-LC3的HeLa和MEF細胞用含有10%類胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長24小時后給藥。GFP-LC3 HeLa細胞接種于96孔板中：①正常組：完全培養(yǎng)基；②給藥組：加入 10 μmol/L 的XGN56或XGN59刺激6 h；③ Baf組：加入0.5 μmol/L Baf處理6 h；⑤自噬潮組：10 μmol/L 的XGN56或XGN59分別與0.5 μmol/L Baf混合處理細胞6 h；GFP-LC3 WT-MEF和GFP-LC3ATG5-/--MEF細胞分別接種于96孔板中：①正常組：完全培養(yǎng)基；②給藥組：加入 10 μmol/L 的XGN56或XGN59處理6 h。處理完畢之后吸去上清，用PBS緩沖液清洗1～2次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察GFP-LC3熒光點。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 化合物與游離ATG4B對接結果

采用Accelrys Discovery Studio 2.5.5軟件進行兩種化合物與蛋白晶體結構的對接分析。兩種天然產(chǎn)物的結構式如圖1A所示。本實驗室前期建立的ATG4B抑制劑虛擬篩選的方法中，已通過軟件尋找到游離型ATG4B晶體結構中可能的對接口袋位置[9]。根據(jù)該口袋位置，我們進行了一步法的分子對接。對接結果顯示，XGN56能與ATG4B(2CY7)分子結構中的ASN261及TRP142兩個氨基酸位點形成氫鍵相互作用(黃色粗短虛線)，且兩者具有良好的結合模式；XGN59能與ATG4B蛋白結構中的ASN261、HIS264及PRO304位氨基酸殘基形成3個氫鍵相互作用，且結合模式良好(圖1B)。

圖1 三白草分離產(chǎn)物XGN56和XGN59的結構式及與ATG4B結合模式Fig.1 Structure of XGN56 and XGN59 extracted from Saururus chinensis (Lour.) Baill and their binding model to ATG4B by molecular docking注：A：XGN56與XGN59結構式；B：XGN56和XGN59與ATG4B的結合模型。Note:A:Structure of XGN56 and XGN59;B:The binding model of XGN56 and XGN59 with ATG4B.

2.2 化合物與ATG4B-LC3復合體對接結果

因為ATG4B在細胞內(nèi)同時參與LC3的脂化與去脂化處理過程，因此，我們猜想這兩個天然產(chǎn)物也應該能與ATG4B-LC3的復合體形成氫鍵相互作用。為了驗證這一猜想，我們使用了ATG4B-LC3復合體(ID：2ZZP)的晶體結構進行下一步的分子對接工作。如圖2A所示,site2口袋是我們所能找到的晶體結構中最大且疏水性最好的口袋，既包含ATG4B結構部分氨基酸(GLU135，GLY136，LYS137，GLN141，TYR143，GLY144，PRO145，ASN146，TYR147，VAL148，GLN150，LYS154)，同時也包含LC3B結構部分氨基酸(GLN43，LEU44，LEU73，ASN74，ASN76，GLN77，ALA78，SER115，GLN116，THR118)。我們選擇該口袋作為ATG4B-LC3復合體與XGN56及XGN59的對接口袋。分子對接結果顯示XGN56可與ATG4B-LC3復合體中的LC3B部分的ASN74、ASN76、THR118位氨基酸形成3個氫鍵相互作用，而XGN59則可與ATG4B-LC3復合體中的LC3B部分的ASN74、GLN77、THR118位氨基酸殘基形成4個氫鍵作用，其中與GLN77位點形成兩個氫鍵，結合力更強(圖2B)。

圖2 分子對接驗證XGN56和XGN59與ATG4B-LC3復合體結合模式Fig.2 Overview of XGN56 and XGN59 binding to ATG4B-LC3 complex by molecular docking注：A：ATG4B蛋白site2口袋晶體結構；B：XGN56和XGN59與ATG4B-LC3復合體結合模型。Note:A:Crystal structure of pocket site2 of ATG4B;B:The binding model of XGN56 XGN59 with ATG4B-LC3 complex.

2.3 化合物對ATG4B酶活性抑制作用

基于化合物與ATG4B具有良好的結合作用，因此我們對化合物進行進一步的活性鑒定。我們采用本實驗室建立的熒光共振能量轉移法(FRET)和考馬斯亮藍染色法檢測兩個化合物對ATG4B酶活性的抑制作用。FRET法是本實驗室建立的一種靈敏的檢測ATG4活性的方法[15]。在ATG4的底物蛋白GATE-16的N端和C末端分別連上CFP與YFP 標簽后，兩者由于距離較近可產(chǎn)生熒光共振能量轉移，產(chǎn)生527 nm處的發(fā)射光。當ATG4酶切底物C端的YFP后，YFP游離，導致CFP與YFP距離較遠，無法產(chǎn)生共振能量轉移，因此只在477 nm處產(chǎn)生發(fā)射光。所以可根據(jù) 527/477 nm 的比值計算ATG4的酶切效率。當加入化合物時，XGN56和XGN59都能劑量依賴地抑制ATG4B的酶切活性。而FRET法測得兩個化合物的IC50值分別為7.74 μmol/L 和8.00 μmol/L，表明兩個化合物對ATG4B有明顯的抑制效果(圖3)。

2.4 化合物對自噬的作用

因為ATG4B發(fā)揮著對自噬標志蛋白LC3的兩種酶切作用，使得LC3能夠參與自噬體的形成與成熟，因此ATG4B活性的調控對自噬具有重要的影響。LC3融合GFP熒光蛋白常用于監(jiān)測自噬的發(fā)生過程。當自噬激活時，GFP標記的LC3-II可聚集于自噬體膜上，此時可通過觀察GFP熒光點的聚集來判斷自噬體的生成。因此我們利用GFP-LC3檢測了XGN56和XGN59對自噬的影響。我們將兩個化合物分別刺激刺激穩(wěn)定過表達了GFP-LC3的HeLa細胞，同時聯(lián)用Baf檢測自噬潮的變化。Baf可以通過阻斷自噬體與溶酶體融合從而阻斷自噬，因此常用于觀察自噬的動態(tài)變化。結果表明，兩個化合物都能促進LC3熒光點的增加，當聯(lián)用Baf后，LC3熒光點較Baf單獨組有明顯的聚集和增多，說明此時LC3二型標記的自噬體形成增多，自噬水平增強(圖4A)。

圖3 SDS-PAGE與FRET法檢測XGN56和XGN59對ATG4B酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of XGN56 and XGN59 on ATG4B activity by SDS-PAGE and FRET assays注：A：SDS-PAGE法檢測酶活性；B：FRET法檢測酶活性。Note:A:Enzyme activity was detected by SDS-PAGE;B:Enzyme activity was detected by FRET.

ATG5也是一種自噬關鍵蛋白，其主要以ATG12-ATG5-ATG16復合物形式參與后期自噬體形成過程。接下來我們檢測了兩個化合物對自噬的調控是否是依賴于ATG5途徑的。我們將XGN56和XGN59分別刺激刺激過表達了GFP-LC3的WT MEF和ATG5-/-MEF細胞。結果顯示，化合物能夠明顯增加WT MEF細胞的熒光點，然而ATG5-/-MEF細胞始終沒有LC3陽性點的生成(圖4B)。以上結果表明XGN56和XGN59對自噬的促進作用是依賴于ATG5途徑的。

3 討論

自噬作為一種保守的生物降解過程，能夠避免某些長壽命蛋白或受損細胞器的累積，對細胞內(nèi)的物質能量代謝更新具有重要的意義。有報道指出自噬的失調可調控多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和細菌感染等[16-18]。因此，ATG4B作為自噬調節(jié)的關鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)及開發(fā)以ATG4B為靶標的調節(jié)劑，從而調控自噬過程在疾病中扮演的角色具有潛在的治療意義。

圖4 XGN56和XGN59對自噬的作用分析Fig.4 The impact of XGN56 and XGN59 on autophagy注：A：化合物誘導自噬，促進自噬潮；B：化合物誘導自噬的作用依賴ATG5。Note:A:Compounds could induce autophagy using GFP-LC3 labelled assay and LC3 flux assay; B:Compounds-induced autophagy dependent on ATG5.

在哺乳動物細胞中，ATG4家族包括四個成員：ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4D，其中ATG4B不管是在結構或者功能上都是研究最為廣泛的ATG4蛋白，其對ATG4家族的特異性底物ATG8家族也表現(xiàn)出最強的酶切活性[15]。目前ATG4B(PDB ID：2CY7)及ATG4B-LC3(PDB ID：2ZZP)復合體的晶體結構都已經(jīng)被報導和解析出來[19,20]，結構的明晰更直觀地展現(xiàn)了ATG4B酶切底物LC3的過程，也為ATG4B調節(jié)劑的篩選提供了結構基礎。

ATG4B作為一種蛋白酶，以其酶切其特異性底物LC3的活性為觀測指標，從而建立一種高通量ATG4B抑制劑篩選體系是目前較為普遍及直接的方法。而本實驗室建立的虛擬對接方法，則是以ATG4B的結構出發(fā)，通過前期的結構對接結合后期的活性驗證，提供了一種較為系統(tǒng)地驗證篩選得的ATG4B抑制劑的方法。本研究驗證得到的ATG4B抑制劑XGN56和XGN59為三白草提取的天然產(chǎn)物，不同于傳統(tǒng)的已知的小分子化合物。ATG4B晶體結構中存在10個可能的與化合物對接的口袋，其中site5口袋包含了ATG4B催化活性中心的兩個重要的氨基酸殘基ASP278和HIS280，本實驗室前期篩選得到的ATG4B抑制劑AG-690/10400046和S130均是通過與該口袋結合從而發(fā)揮抑制作用[9,21]。而本研究中的兩個化合物XGN56和XGN59則主要是與ATG4B的site2疏水口袋結合，且與ATG4B及ATG4B-LC3復合體均有較好的結合作用，能夠顯著抑制ATG4B活性，IC50值分別為7.74 μmol/L 和8.00 μmol/L，優(yōu)于已報道的ATG4B小分子抑制劑NSC185058(IC50=51 μmol/L)及AG-690/10400046(IC50=36.8 μmol/L)[8,21]。因此，這提示我們除了游離型ATG4B結構中的site5活性口袋，復合體結構的site2口袋也可作為ATG4B調節(jié)劑虛擬篩選時的對接口袋，從而篩選出結合能力更強，抑制效價更高的化合物。而且我們也證明了XGN56和XGN59可ATG5依賴地促進細胞自噬水平，說明兩個天然產(chǎn)物具有潛在的生理意義，可能會通過自噬途徑參與某些疾病或者腫瘤的調控過程。

因此，本研究通過虛擬對接結合體外活性測定，驗證并得到了從三白草中分離的ATG4B的天然化合物抑制劑XGN56和XGN59，并且尋找到了一個新的化合物與ATG4B結合的口袋，為后續(xù)尋找并開發(fā)更高效的ATG4B調節(jié)劑提供研究基礎，也為以ATG4B為靶標的天然產(chǎn)物在臨床治療中的應用奠定了重要的意義。