丁楊芳，李德芳，陳小宇，任博雪，趙 微，鄭秋生,*

1 石河子大學(xué)藥學(xué)院 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，石河子 832002;2濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，煙臺 264003

黑色素瘤是皮膚癌中最致命的高度惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，2018年新發(fā)黑色素瘤病例287 723例，死亡60 712例[1]。黑色素瘤在早期時可以診斷出來并且可以通過手術(shù)切除治愈，然而當(dāng)癌細(xì)胞擴散轉(zhuǎn)移后，治療會變得非常棘手甚至?xí)绊懟颊叩纳尜|(zhì)量。除外科手術(shù)外，治療惡性黑色素瘤的方法還有放療，化療，生物治療以及靶向治療等[2]。放療與化療都可以在一定程度上對抗癌細(xì)胞的生長，但是這兩種治療方法都會帶來諸多的不良反應(yīng)且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此，尋找具有潛在抗腫瘤的活性化合物就顯的尤為重要。

新狼毒素A是從瑞香狼毒StellerachamaejasmeL.或狼毒大戟EuphorbiafischerianaSteud.和月籐大戟EuphorbiaehracteolataHayata.的根中提取出來的具有多種生理活性的黃酮類化合物。狼毒中的主要活性成分有黃酮類、香豆素類、二萜類、木脂素類、倍半萜類、苯丙醇苷類、揮發(fā)油、氨基酸、三萜類、樹脂等[3]。研究表明，狼毒具有抗病毒[4]、調(diào)節(jié)免疫活性[5]、抑菌[6]、殺蟲[7]、抗癲癇[8]，除此之外還具有抗腫瘤[9]的作用。而狼毒有效成分抗腫瘤的機制有以下方面如抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10,11]、抗多藥耐藥性[12]、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期[13]和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)新狼毒素A除了具有殺蟲的功效外還可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖且誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[15]。然而，至今沒有關(guān)于新狼毒素A對人黑色素瘤細(xì)胞的影響的詳細(xì)報道，本研究選用狼毒中活性成分新狼毒素A，探究新狼毒素A在體外對人黑色素瘤A375增殖的抑制作用及對細(xì)胞凋亡的影響。為新狼毒素A的研究與開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人黑色素瘤A375從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買。

1.2 藥品及主要試劑

新狼毒素A(武漢ChemFaces公司，純度≥98%，批號：CFS01701)；噻唑藍(lán)(MTT)(批號：1117X054)，胰蛋白酶(批號：8250024)，Hoechst 33258熒光染料(批號：1225A0310)，高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液(批號：20180321)和DMSO(批號：520C0324)均購于北京索萊寶公司；DMEM培養(yǎng)基(批號：1645781)購于Gibco公司；胎牛血清(FBS)(批號：J30329)購于北京全式金公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(批號；20171122)和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(批號：20170913)購于凱基生物；Anti-Bax,anti-Bcl-2和anti-Cytochrome C(批號：5023T，3498T和4280T)均購于美國Cell Signaling Technology公司；Anti-caspase-3(批號：GR219726-18)購于Abacm公司；β-actin(批號：17AV0411)，山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記lgG(H+L)(批號：131224)和山羊抗兔辣根酶標(biāo)記lgG(H+L)(136080)購于北京中杉金橋生物公司；ECL高效發(fā)光液(TA260115)購于美國Thermo；青鏈霉素(批號：J160021)購于Hyclone公司。

1.3 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，Thermo 3131型)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，Thermo 3001型)；倒置生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司，BDS200-PH)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司， FACSCalibur/Calibur)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(EC3 510 Imaging System，美國思博明科學(xué)器材有限公司)；半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(BIO RAD公司，Trans-Blot SD Cell)；脫色搖床(北京六一儀器廠，WD-9405D)；艾柯實驗室超純水機(成都艾柯水處理設(shè)備有限公司，Exceed-Ad-60)。

2 實驗內(nèi)容

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及新狼毒素A儲備液的配制

用DMEM(使用時加10% FBS和1%雙抗)培養(yǎng)A375細(xì)胞，完全的DMEM配制：將一包DMEM粉末倒入1 000 mL的燒杯里，加入1 000 mL的超純水溶解均勻并加入3.7 g的NaHCO3，并用0.22 μm的濾膜過濾，目的在于除菌，過濾好的DMEM培養(yǎng)基分裝后在4 ℃冰箱備用，使用時加入10%的FBS和1%的雙抗(青霉素和鏈霉素)。A375細(xì)胞用配制好的完全培養(yǎng)基置于溫度為37 ℃,5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3天消化傳代一次。

新狼毒素A儲備液的配制：取10 mg的新狼毒素A于200 μL的EP管中，同時向EP管中加入184.5 μL的DMSO，得到1×105μmol/L的母液，封裝放置于-20 ℃長期保存。

2.2 新狼毒素A對A375細(xì)胞增殖能力的影響

將對數(shù)生長期(生長到80%～90%)的A375細(xì)胞消化后，按每孔100 μL鋪于96孔板(1×105個/mL)培養(yǎng)24 h，然后吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A的培養(yǎng)基(0、15、30、45、60 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24 h或48 h，吸出舊的含藥培養(yǎng)基加入含MTT(5 mg/mL)的新鮮培養(yǎng)基10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用150 μL的DMSO代替含MTT的培養(yǎng)基，并在振蕩儀上震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測吸光度(570 nm)并計算其抑制率。

2.3 Hoechst 33258觀察細(xì)胞形態(tài)

取處于對數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于6孔板(3×105個/mL)，每孔2 mL培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A的培養(yǎng)基(0、15、30、45 μmol/L)培養(yǎng)48 h，用PBS洗滌2遍細(xì)胞后加入1 mL的固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)作用15 min，PBS洗2遍，加入Hoechst 33258染料(Hoechst 33258∶PBS=1∶1 000)作用10 min，棄去染料，用PBS洗滌后加入PBS浸沒A375細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察新狼毒素A作用于細(xì)胞后對細(xì)胞形態(tài)的改變。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

取處于對數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于6孔板(3×105個/mL)，每孔加2 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A的培養(yǎng)基(0、15、30、45 μmol/L)作用48 h，收集細(xì)胞，用PBS洗2遍，加入500 μL的Binding Buffer，輕輕混勻后，再加入5 μL的Annexin V-FITC，輕輕混勻，再加入5 μL的PI染色10 min后，用流式細(xì)胞儀檢測新狼毒素A作用于細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率。

2.5 JC-1染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化

將對數(shù)生長期(生長到80%～90%)的細(xì)胞接種于6孔板(3×105個/mL)，24 h后吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A培養(yǎng)基(0、15、30、45 μmol/L)作用48 h，收集細(xì)胞，加入用稀釋好的JC-1溶液500 μL在37 ℃孵育20 min，稀釋好的1×Incubation Buffer洗滌2次，加入500 μL的1×Incubation Buffer混勻細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測新狼毒素A作用于細(xì)胞48 h后細(xì)胞線粒體膜電位的變化，酶標(biāo)儀檢測紅色與綠色熒光，以紅色與綠色熒光比值代表線粒體線粒體膜電位的變化。

2.6 Western blot檢測Bax，Bcl-2，caspase-3和Cytocheome C的蛋白表達(dá)

取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于中培培養(yǎng)(5×105個/mL)，24 h后吸出舊培養(yǎng)基，加入含新狼毒素A培養(yǎng)基使其終濃度為(0、15、30、45 μmol/L)作用48 h后，加入高效細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，并且每5 min來回晃動幾下，裂解結(jié)束后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下后離心(12 000 rpm，5 min)，收集上清蛋白，在-80 ℃冰箱備用。

將提取好的蛋白用4×蛋白上樣緩沖液和電泳液煮蛋白后加入到15%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將SDS-PAGE膠上的特定蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉或者5% BSA封閉PVDF膜2 h，20 mL的TBST溶液洗4次膜(每次5 min)，洗膜結(jié)束后用稀釋好的一抗抗體孵育過夜，次日用20 mL的TBST溶液洗膜(4次，每次5 min)，結(jié)束后用相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，同樣用20 mL的TBST溶液洗洗4次膜(每次5 min)，用ECL發(fā)光液浸沒膜，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光條帶，用Image J處理數(shù)據(jù)。

2.7 數(shù)據(jù)處理

以上所有實驗至少重復(fù)3次，用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢測進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)檢測。P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，P<0.01表示具有統(tǒng)計學(xué)上的極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 新狼毒素A抑制A375 細(xì)胞的增殖

如圖1所示，不同濃度的新狼毒素A處理A375細(xì)胞24 h和48 h后，與正常組相比，新狼毒素A處理組細(xì)胞的抑制率隨著新狼毒素A濃度的增加和時間的延長也逐漸增加。給藥48 h時各組細(xì)胞抑制率分別為22.88%±4.50%，31.49%±3.61%，51.64%±4.47%和59.4%±5.20%。

圖1 新狼毒素A抑制A375細(xì)胞的增殖(n=3)Fig.1 Effect of Neochamaejasmin A on proliferation in A375 cells(n=3)注：與正常組相比,**P<0.01。Note:**P<0.01,compared with normal group.

3.2 新狼毒素A誘導(dǎo)A375細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變

如圖2所示，新狼毒素A處理細(xì)胞48 h后，正常組細(xì)胞呈圓形或橢圓形，熒光染色均勻，細(xì)胞飽滿透亮。新狼毒素A處理A375細(xì)胞后出現(xiàn)顯著的凋亡特征如組細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞體積變小，皺縮，核質(zhì)濃縮，凋亡小體形成。

3.3 新狼毒素A誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡

不同濃度新狼毒素A作用于A375細(xì)胞48 h后，各組細(xì)胞總凋亡率分別為 2.88%±0.9%，21.39%±4.93%，30.96%±4.77%和44.78%±5.43%，此結(jié)果顯示，與正常組相比，新狼毒素A處理組細(xì)胞凋亡率隨著濃度的增加而逐漸增加，且呈劑量依賴性(P<0.01)(如圖3)。

3.4 新狼毒素A降低A375細(xì)胞線粒體膜電位

如圖4所示，不同濃度的新狼毒素A作用于細(xì)胞后，細(xì)胞的紅色熒光與綠色熒光的比值隨著新狼毒素A濃度的增大而逐漸降低且呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.01)，這說明新狼毒素A降低了A375細(xì)胞線粒體膜電位。

圖2 新狼毒素A對A375細(xì)胞形態(tài)的影響 (×400)(n=3)Fig.2 Effect of Neochamaejasmin A on morphology in A375 cells (×400)(n=3)

圖3 新狼毒素A誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡(n=3)Fig.3 Effect of Neochamaejasmin A on apoptosis rate in A375 cells(n=3)注：與正常組相比,**P<0.01。Note:**P<0.01,compared with normal group.

圖4 新狼毒素A誘導(dǎo)A375細(xì)胞線粒體膜電位的改變(n=3)Fig.4 Effect of Neochamaejasmin A on mitochondrial membrane potential in A375 cells(n=3)注：與正常組相比, **P<0.01。Note:**P<0.01,compared with normal group.

3.5 新狼毒素A誘導(dǎo)Bax，Bcl-2和caspase-3和Cytochrome C的蛋白改變

如圖5所示，與正常組相比，各處理組A375細(xì)胞的Bax，caspase-3和Cytochrome C的蛋白表達(dá)顯著增加，而Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)。這表明新狼毒素A通過線粒體途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞的凋亡。

圖5 新狼毒素A引起A375細(xì)胞Bax，Bcl-2，caspase-3和Cytochrome C的蛋白改變(n=3)Fig.5 Effect of Neochamaejasmin A on Bax，Bcl-2,caspase-3 and Cytochrome C in A375 cells(n=3)注：與正常組相比,*P<0.05；**P<0.01。Note:*P<0.05;**P<0.01,compared with normal group.

4 討論

黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而來的惡性程度很高的人類腫瘤，其具有轉(zhuǎn)移性高的特點。現(xiàn)有的一些化療藥物不僅無法起到預(yù)期的效果還具有很大的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生存健康。而從天然化合物中尋找活性物質(zhì)成為了很多學(xué)者研究的焦點。

研究表明，狼毒里的多種有效成分都能顯著抑制多種細(xì)胞的增殖[10,11]。為了探究新狼毒素A是否能影響A375細(xì)胞的生長和增殖，MTT實驗用于檢測 A375細(xì)胞的活力，在本實驗中新狼毒素A以時間劑量依賴性的方式顯著抑制A375細(xì)胞的生長和增殖。 Hoechst 33258結(jié)果顯示新狼毒素A處理A375細(xì)胞后，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞皺縮，核質(zhì)濃縮且凋亡小體形成。這表明新狼毒素A顯著抑制A375細(xì)胞的增殖，這種作用可能是通過誘導(dǎo)凋亡來實現(xiàn)的。Bcl-2家族在凋亡途徑中起著至關(guān)重要的作用[16]。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或者外部的刺激后，位于細(xì)胞質(zhì)中的Bax會被召集到線粒體膜上，幫助細(xì)胞色素C釋放至細(xì)胞質(zhì)從而活化caspase家族啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。存在于線粒體膜上的Bcl-2蛋白能穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細(xì)胞色素C的釋放，而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[17]。Bax和Bcl-2的比率能判斷細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時，Bcl-2會與Bax形成異源二聚體而抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax高表達(dá)時，Bax會自身形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。caspase家族是細(xì)胞凋亡信號通路的共同通路，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的執(zhí)行者。當(dāng)Bax被激活后，從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入線粒體后，線粒體膜通透性會因此而發(fā)生改變，Cytochrome C及其他凋亡誘導(dǎo)因子也會因此大量釋放[19]，細(xì)胞色素C能夠與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成聚合物，活化procaspase-9成為具有活性的caspase-9，誘使下游的procaspase-3活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2不僅是caspase-3的上游，還可以作為caspase-3的直接底物[20]。本實驗結(jié)果顯示新狼毒素A作用A375細(xì)胞后，凋亡率隨著新狼毒素A劑量的增加而逐漸增加，而線粒體膜電位卻在逐漸降低，除此之外，線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)如Bax，caspase-3和Cytochrome C的表達(dá)逐漸增加，但Bcl-2的蛋白表達(dá)逐漸減少。

以上結(jié)果綜合表明，新狼毒素A能顯著抑制A375細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其機制可能與誘導(dǎo)線粒體途徑的凋亡有關(guān)。