晏仁義，李瓊婭，徐 冰*，陳若蕓

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050；2華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)中心，深圳 518110

氮雜糖(azasugar)又稱多羥基生物堿(polyhydroxy alkaloid)、亞氨基糖(iminosugar)和糖型生物堿(sugar-mimic alkaloid)等，指糖環(huán)上氧原子被氮原子取代而形成的一類化合物。藥理學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)多羥基生物堿具有高效的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性，糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶在腸道的消化、糖蛋白加工、溶酶體代謝等生理過程中起著十分重要的作用，因此多羥基生物堿具有抗糖尿病、抗癌、抗病毒、治療溶酶體貯積癥等多種藥理活性。1996年作為α-葡萄糖苷酶抑制劑治療Ⅱ型糖尿病的米格列醇片開發(fā)成功。2003年ZavescaTM上市，為第一個(gè)口服治療戈謝病的藥物。使得這一研究領(lǐng)域具有重要前景，吸引了廣大學(xué)者的興趣。出版的專著和綜述，從不同方面對(duì)多羥基生物堿進(jìn)行了報(bào)道[1-6]。

α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶，減緩淀粉分解為葡萄糖的速度，減少和延緩小腸對(duì)葡萄糖的吸收，降低血糖濃度，對(duì)餐后高血糖的降低作用比較明顯。同時(shí)不刺激胰島素的分泌，單獨(dú)使用通常不會(huì)引發(fā)低血糖。是治療無明顯空腹高血糖，以餐后血糖升高為主的Ⅱ型糖尿病患者的常用藥。目前臨床上常用的藥物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等[7]。

白樹(Suregadaglomerulata)為大戟科白樹屬(Suregada，又名Gelonium)植物。本組對(duì)白樹進(jìn)行了較為深入的研究，發(fā)表了系列論文。尤其是闡明了其糖苷酶抑制活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，得到一系列結(jié)構(gòu)新穎的多羥基生物堿[8-10]，為開發(fā)該植物提取物來源的降血糖天然藥物打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究在以前的基礎(chǔ)上，對(duì)分離得到的五個(gè)氮雜糖的N上進(jìn)行了衍生，并分析對(duì)其活性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance 300 MHz，Bruker Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振儀，D2O為溶劑(加DSS為內(nèi)標(biāo))。強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹脂Dowex 50×4-400及強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂Dowex 1×2-400和弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂Amberlite CG-50為百靈威試劑公司進(jìn)口分裝。水為市售去離子水。所用試劑甲酸、甲醛、溴代丁烷、碘化鉀、無水碳酸鉀、氨水、鹽酸及氫氧化鈉均為分析純，北京化工廠生產(chǎn)。30%過氧化氫為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。TLC顯色劑配制：1% KI溶液7.5 mL和o-tolidine溶液(o-tolidine 1 g溶于2 %乙酸溶液250 mL中)17.5 mL混合。

1.2 化合物衍生合成

1.2.1 N-甲基化衍生物的制備

5-O-α-D-galactopyranosyl-α-homonojirimycin和6-deoxy-homoDMDP分別用0.2 mL水溶解，加入37%的HCHO溶液0.8 mL，80 %的HCOOH溶液0.8 mL，80 ℃反應(yīng)5小時(shí)，蒸干。用水溶解，過Dowex 50×4-400(H+)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂柱(20 mL)，40 mL蒸餾水洗后，用40 mL的0.5 M的氨水洗，收集氨水洗脫部分，蒸干。水溶解，過Dowex 1×2-400(OH-)強(qiáng)堿性陰離子樹脂柱純化(10 mL)，收集蒸餾水洗脫部位(20 mL)，蒸干即得[11]。分別得到化合物6和7。

1.2.2 N-丁基化衍生物的制備

α-4-deoxyhomonojirimycin用0.2 mL DMF溶解，加入適量溴代正丁烷50 μL和0.15 g無水K2CO3，將混合物加熱到100 ℃，反應(yīng)24 h。過濾，將濾液過Dowex 50×4-400(H+)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂柱(20 mL)，40 mL蒸餾水洗后，用40 mL的0.5 M的氨水洗，收集氨水洗脫部分，蒸干。水溶解，經(jīng)Dowex 1×2-400 (OH-)強(qiáng)堿性陰離子樹脂柱純化(10 mL)，蒸餾水洗脫，TLC檢測(cè)，收集純化部位，蒸干即得化合物1[12]。

1.2.3 N-氧化衍生物的制備

N-methyl-α-7-deoxyhomonojirimycin和N-methyl-α-homonojirimycin分別用0.1 mL的H2O溶解，加入30%雙氧水3.0 mL，室溫?cái)嚢瑁磻?yīng)3天，蒸干即得化合物3和5[13]。

1.2.4 N,N-二甲基化衍生物的制備

N-methyl-α-4-deoxyhomonojirimycin和N-methyl-α-7-deoxyhomonojirimycin用0.1 mL的DMF溶解，加入MeI(0.5 mL)，室溫?cái)嚢?，反?yīng)12 h，蒸干。1 mL水溶解后用Dowex 1×2-400 (OH-) 強(qiáng)堿性陰離子樹脂柱純化[14]。蒸干即得化合物2和4。

1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試

從小鼠小腸獲得的糖苷酶溶液(100 μL)與化合物的各種濃度溶液(0.01～40.00 mol/L)80 μL混合，然后加入20 μL的100 mg/mL蔗糖的磷酸鹽緩沖液(pH6.0)，開始反應(yīng)。在37 ℃下，溫孵30分鐘后，在80～85 ℃下溫孵3分鐘終止反應(yīng)。取其中5 μL加入195 μL葡萄糖氧化酶(GOD)測(cè)定酶液，37 ℃溫孵40 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)定505 nm處的吸光度，以葡萄糖的生成量計(jì)算α-葡萄糖苷酶的活性；同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照(Acarbose)。根據(jù)不同濃度下的抑制率計(jì)算半數(shù)有效抑制濃度IC50。酶的抑制率通過以下公式計(jì)算：(ODreaction-ODsample)/(ODreaction- ODblank)× 100%。IC50值表示在測(cè)量條件下50 %酶被抑制的抑制劑濃度，根據(jù)樣品各種濃度下的抑制率來計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1～7均通過衍生合成得到，衍生的底物結(jié)構(gòu)明確。因此，通過測(cè)試1H NMR、13C NMR和MS的數(shù)據(jù)確定衍生合成的新成分的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試結(jié)果

按照1.3中的方法對(duì)化合物1～7的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表1。

3 討論

本課題組前期發(fā)表的論文中指出[8]，哌啶烷類的氮雜糖如α-4-deoxyhomonojirimycin和α-7-deoxyhomonojirimycin的N-甲基化衍生物能顯著增強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制活性。然而本研究結(jié)果表明這兩個(gè)化合物氮上其他衍生物(化合物1～4)的活性未見增強(qiáng)?；衔?具有一定的抑制活性，但是與氮上未氧化的母體化合物相比(IC500.08 μmol/L)活性降低了不少?；衔?的數(shù)據(jù)表明不是所有的哌啶烷類氮雜糖N-甲基化衍生物能增強(qiáng)活性?；衔?屬于吡咯烷類氮雜糖，同樣N-甲基化衍生物也未增強(qiáng)活性，這也與前期的報(bào)道結(jié)果一致[8]；體內(nèi)外活性都較強(qiáng)的homoDMDP(IC500.92 μmol/L)，其N-甲基化衍生物活性降低較多(IC50> 40 μmol/L)。哌啶烷類N上丁基取代生成叔胺不能增強(qiáng)活性，說明合適碳鏈的取代基對(duì)活性重要；生成季銨后活性降低，可能與位阻有關(guān)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開展此類化合物的結(jié)構(gòu)改造提供了參考。

表1 化合物1～7的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 1 Effect on α-glucosidase of compounds 1-7