劉學勇，姬志勤,2*

1西北農(nóng)林科技大學植物保護學院；2陜西省植物源農(nóng)藥研究與開發(fā)重點實驗室，楊凌 712100

天葵子為毛茛科植物天葵(Semiaquilegiaadoxoides)的干燥塊根。作為一種傳統(tǒng)中藥，用于治療腫瘤，乳癰，腎病等多種疾病[1]。其化學成分已經(jīng)研究得較為透徹，主要有內(nèi)酯及香豆素類、生物堿類、酚酸類、二萜類、硝基類及氰基類等[2]。目前在農(nóng)用活性方面報道較少[3-5]，筆者對天葵子的化學成分進行分離鑒定，并測定其對幾種常見農(nóng)業(yè)致病菌的抑菌活性，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：島津 SCL-10Avp高效液相色譜儀(日本島津公司)；Bruker RPX 500 MHz核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)；柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；柱層析硅膠(300～400目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(美國通用電氣公司)；SENCO R210BL旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；SENCO W201/W501恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；Thermo Fisher LCQ Advantage 質譜儀(美國熱電公司)；WRR熔點儀(上海精密科學儀器有限公司)；BWXG200半自動旋光儀(貝爾分析儀器有限公司)。

藥品：硫酸鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)。

試劑：石油醚、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、二氯甲烷、氯仿等均為國產(chǎn)分析純；水為實驗室自制超純水。

1.2 植物材料

2016年5月購于安國市仁德興藥材有限公司，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院王康才教授鑒定為毛茛科天葵屬植物天葵的干燥快根。藥材標本存于西北農(nóng)林科技大學農(nóng)藥研究所。

1.3 供試菌株

獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae)；青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)；白菜軟腐病菌(Erwiniacarotovorapv.Carotovora)；魔芋軟腐病菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(Jones) Bersey et al.)，菌種由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院農(nóng)藥研究所提供。

1.4 提取與分離

取天葵子樣品20 kg，粉碎，甲醇超聲提取3次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，得到浸膏。將浸膏加水稀釋懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇1∶1萃取三次，濃縮得到石油醚相(141 g)、乙酸乙酯相(41 g)、正丁醇相(156 g)和水相(742 g)。取乙酸乙酯相用甲醇溶解，硅膠干法上樣，以石油醚濕法裝柱，硅膠柱依次用石油醚、V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 100∶1、20∶1、10∶1、7∶1、3∶1、1∶1、乙酸乙酯和甲醇梯度洗脫，分別得到Y1(4.23 g)、Y2(2.45 g)、Y3(2.23 g)、Y4(1.03 g)、Y5(1.62 g)、Y6(1.43 g)、Y7(2.10 g)、Y8(1.78 g)、Y9(3.23 g)共9個組分。其中Y6經(jīng)硅膠柱以石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(10∶1→ 8∶1→ 6∶1→ 4∶1→ 2∶1→ 1∶1→ 0∶1)，得到流份Y61-Y67，從Y64流份中進一步重結晶獲得化合物3(25.2 mg)；Y65流份經(jīng)硅膠柱層析，石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)等度洗脫(3∶1),獲得化合物1(7.3 mg)、化合物5(6.1 mg)、化合物6(7.1 mg)；Y7流份經(jīng)凝膠甲醇水純化得到化合物10(4.5 mg)。

正丁醇相以二氯甲烷/甲醇系統(tǒng)硅膠柱層析，濕法裝柱，干法上樣,依次用體積比為20∶1、10∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1的洗脫劑洗脫，得到Z1(6.31 g)、Z2(10.13 g)、Z3(12.45 g)、Z4(15.26 g)、Z5(12.75 g)、Z6(8.23 g)、Z7(6.45 g)、Z8(26.42 g)共8個流份，Z2經(jīng)二氯甲烷/甲醇(15∶1)等度洗脫，獲得Z21-Z216共16個流份，Z25中析出大量白色粉末，甲醇反復淋洗，得到化合物4(17.2 mg),Z28經(jīng)甲醇重結晶，獲得化合物2(67.2 mg)；Z5用氯仿-甲醇-水(8∶2∶0.2)等度洗脫，共收集Z501-Z520共20個流份，每個流份200 mL，Z510經(jīng)液相制備，獲得化合物12(1.9 mg)；Z511和Z512合并經(jīng)氯仿-醇-水(8∶2∶0.2)反復硅膠柱層析，得到化合物7(10.1 mg)、化合物9(40.6 mg)；Z6經(jīng)氯仿-甲醇-水(4∶2∶1)反復硅膠柱層析，并結合薄層制備，獲得化合物8(20.4 mg)；Z7經(jīng)過丙酮洗滌，再經(jīng)重結晶，獲得化合物11(205.3 mg)，丙酮洗滌液濃縮后經(jīng)液相制備，獲得化合物13(12.4 mg)。

1.5 抑菌活性測定

采用濾紙片瓊脂擴散法[6]分別測定了石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相及所分離化合物對4種供試病原菌的抑制活性。各相組份以10%的丙酮水配制成質量濃度為10 mg/mL的樣品混懸液，各單體化合物用10%的丙酮水配制成1 mg/mL的樣品溶液，取5 μL樣品溶液轉移至直徑為6 mm的滅菌濾紙片，每片載藥量為5 μg(各萃取相載藥量為50 μg)，待溶劑揮發(fā)干后，均勻置于含菌平板上，每個平板放置6個濾紙片。溶劑對照為10%丙酮水溶液，陽性對照為硫酸鏈霉素(載藥量0.5 μg/片)。28 ℃培養(yǎng)12 h后觀察實驗結果，直尺測量結果并記錄。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1無色針狀結晶(CH3OH)，易溶于甲醇、四氫呋喃，難溶于氯仿；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.63 (1H,m,H-4),6.33 (1H,d,J= 9.2 Hz,H-5),5.84 (1H,br s,H-2),5.03 (1H,m,H-8),4.57 (1H,m,H-6),2.82 (1H,m,H-7a),1.54 (1H,m,H-7b);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:175.9 (C-1),166.3 (C-3),146.1 (C-5),120.4 (C-4),111.5 (C-2),80.1 (C-8),67.3 (C-6),41.1 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道一致，故鑒定為蝙蝠葛內(nèi)酯。

化合物2無色針狀結晶(CH3OH)，易溶于甲醇、四氫呋喃，難溶于氯仿；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:6.56 (1H,dd,J= 2.7,9.8 Hz,H-4),6.33 (1H,dd，J= 9.8,92.1 Hz,H-5)，5.99 (1H，br s,OH-6)，5.94 (1H,s,H-2),5.62 (1H，s,OH-7),4.87 (1H,dd,J= 1.9,10.6 Hz,H-8),4.18 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-6),3.36 (1H,t,J= 9.2 Hz,H-7);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:172.9 (C-2),163.0 (C-3),144.0 (C-5),118.7 (C-4),110.6 (C-3),82.9 (C-8),78.0 (C-7),71.4 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定為格列風內(nèi)酯。

化合物3白色針狀結晶(CH3Cl)，無紫外吸收，易溶于氯仿、甲醇。硫酸薄層顯色為紫紅色；1H NMR (CDCl3500 MHz)δ:5.34 (1H,dd,J= 5.0,2.0 Hz,H-6),3.51 (1H,tt,J= 11.06,4.63,4.63,H-3),1.00 (3H,s,H-18,19),0.92 (3H,d,J= 6.5 Hz,H-21),0.85 (3H,t,J= 7.1 Hz,H-27),0.82 (3H,d,J= 4.1 Hz,H-29),0.80 (3H,d,J= 4.1 Hz,H-26),0.67 (3H,s,H-18);13C NMR (CDCl3125 MHz)δ:140.9 (C-5),121.8 (C-6),71.9 (C-3),56.9 (C-14),56.3 (C-17),50.3 (C-9),46.0 (C-24),42.5 (C-4),42.5 (C-13),39.9 (C-12),37.4 (C-1),36.7 (C-10),36.3 (C-20),34.1 (C-22),32.1 (C-8),32,1 (C-7),31.8 (C-2),29.4 (C-25),28.4 (C-23),26.4 (C-16),24.4 (C-15),23.3 (C-28),21.3 (C-11),19.9 (C-26),19.5 (C-19),19.2 (C-27),18.9 (C-21),12.1 (C-29),12.0 (C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物4白色塊狀物，無紫外吸收，微溶于氯仿、甲醇，溶于四氫呋喃。硫酸薄層顯色為紫紅色，三種溶劑系統(tǒng)TLC檢測Rf值與胡蘿卜苷對照品相同，故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物5白色針狀結晶(CH3OH)，溶于甲醇，難溶于氯仿；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.06 (2H,d,J= 8.5 Hz,H-2,6),6.73 (2H,d,J= 8.5 Hz,H-3,5),3.71 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-8),2.7 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:156.8 (C-4),131.0 (C-1),130.9 (C-2,6),116.1 (C-3,5),64.6 (C-8),39.4 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道一致，故鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物6棕色油狀物，易溶于乙酸乙酯；1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:7.70 (2H,t,J= 8.4 Hz,H-3,6),7.53 (2H,t,J= 8.4Hz,H-4,5),4.26 (2H,m,H-1′,1′′),1.71 (2H,dt,J= 12.0,6.1 Hz,H-2′,2′′) ″,1.43 (2H,m,H-7′,7′′),1.36 (4H,s,H-5′,5′′),1.31 (4H,m,H-3′,3′′),0.96 (4H,t,J= 7.3 Hz,H-6′,6′′),0.90 (6H,t,J= 7.3 Hz,H-8′,8′′);13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:168.0 (C-7,8),132.5 (C-1,2),131.2 (C-4,5),129.1 (C-3,6),68.4 (C-1′,1′′),39.0 (C-2′ 2′′),30.8 (C-3′,3′′),29.1 (C-4′,4′′),24.00 (C-7′,7′′),23.2 (C-5′,5′′),14.2 (C-6′,6′′),11.2 (C-8′,8′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸-二-2-乙基-己酯。

化合物7黃色針狀結晶(CH3OH)，溶于甲醇、水；紫外燈下下顯黃色熒光，改良碘化鉍鉀薄層顯色陽性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:9.92 (1H,s,H-8),8.98 (1H,s,H-13),8.20 (1H,d,J= 9.1Hz,H-11),8.01 (1H,d,J= 9.1 Hz,H-12),7.79 (1H,s,H-1),7.09 (1H,s,H-4),6.17 (2H,OCH2O),4.96 (2H,t,J= 6.3 Hz,H-6),4.10 (3H,s,OCH3-10),4.07 (3H,s,OCH3-9),3.21 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-5);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:150.4 (C-10),149.8 (C-3),147.6 (C-2),145.5 (C-8),143.6 (C-9),137.4 (C-13a),133.0 (C-12a),130.7 (C-4a),126.7 (C-11),123.6 (C-12),121.4 (C-8a),120.5 (C-13b),120.2 (C-13),108.4 (C-4) 105.5 (C-1),102.1 (OCH2O),62.0 (OCH3-9),57.1 (C-6),55.2 (OCH3-10),26.3 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為小檗堿。

化合物8黃色無定形粉末，易溶于水、甲醇；紫外燈下顯亮藍色熒光，改良碘化鉍鉀顯色陽性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:6.71 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-9),6.62 (1H,s,H-3),6.52 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-8),4.36 (1H,d,J= 13.5 Hz,H-6a),3.72 (3H,s,OCH3-10),3.70 (3H,s,OCH3-2),3.58 (2H,m,H-5),3.32 (3H,s,N-CH3),3.17 (1H,m,H-4a),3.14 (1H,m,H-7a),2.89 (3H,s,N-CH3),2.84 (1H,dd,J= 18.0,4.8 Hz,H-4b),2.62 (1H,t,J= 13.1 Hz,H-7b);13CNMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:150.5 (C-2),149.7 (C-10),149.3 (C-1),148.7 (C-11),125.1 (C-7a),121.9 (C-11a),121.6 (C-11b),120.0 (C-11c),114.3 (C-8),114.0 (C-3a),109.8 (C-9),108.8 (C-3),68.6 (C-6a),60.0 (C-5),55.5 (OCH3-10),55.1 (OCH3-2),52.5 (N-CH3),42.3 (N-CH3),30.0 (C-7),23.0 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定為木蘭堿。

化合物9黃色針狀結晶(CH3OH)，ESI-MSm/z322 [M]+；易溶于水、甲醇；紫外燈下顯黃色熒光，改良碘化鉍鉀顯色陽性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:9.74 (1H,s,H-8),8.86 (1H,s,H-13),8.32 (1H,s,OH-10),7.86 (1H,d,J= 9.1Hz,H-11),7.86 (1H,d,J= 9.1 Hz,H-12),7.79 (1H,s,H-1),7.08 (1H,s,H-4),6.16 (2H,OCH2O),4.90 (2H,t,J= 6.3 Hz,H-6),4.06 (3H,s,OCH3-9),3.19 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-5);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:151.1 (C-3),149.7 (C-10),147.7 (C-2),144.2 (C-8),141.3 (C-9),136.9 (C-14),132.6 (C-12a),131.2 (C-11),130.5 (C-4a),123.6 (C-12),122.2 (C-8a),120.6 (C-14a),120.3 (C-13),108.4 (C-4),105.5 (C-1),102.1 (OCH2O),63.1 (OCH3-9),55.1 (C-6),26.4 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7,14]報道基本一致，故鑒定為唐松草酚定。

化合物10白色粉末，易溶于水、甲醇；無紫外吸收，硫酸薄層顯色為黑色，與果糖共薄層，三種溶劑系統(tǒng)展開均有相同的Rf值，故鑒定為果糖。

化合物11白色針狀結晶(H2O)， 易溶于水，微溶于甲醇；1H NMR (D2O,500 MHz)δ:6.39 (1H,dd,J= 10.2,2.0 Hz,H-4),6.18 (1H,dd,J= 9.9,3.1 Hz,H-5),5.69 (1H,s,H-2),4.91 (2H,d,J= 7.3 Hz,H-8,H-1′),4.87 (1H,m,H-8),4.33 (1H,dt,J= 5.4,2.5,2.5 Hz,H-6),3.96 (1H,m,H-7),3.76 (1H,dd,J= 12.3,5.7 Hz,H-6′),3.42-3.53 (4H,m,H-2′,3′,4′,5′ );13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:155.3 (C-3),138.1 (C-5),125.9 (C-4),117.1 (C-1),102.3 (C-1′),96.7 (C-2),76.9 (C-3′),76.5 (C-8),75.3 (C-5′),73.5 (C-7),73.0 (C-2′),70.2 (C-6),69.7 (C-4′),61.5 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定為紫草氰苷。

化合物12紅色針狀結晶(CH3OH)，易溶于甲醇，微溶于水；1H NMR (CD3OD,500 MHz) δ:9.24 (1H,s,H-8),8.25 (1H,s,H-13),7.64 (1H,d,J= 8.1 Hz,H-11),7.56 (1H,s,H-12),7.48 (1H,H-1),6.90 (1H,s,H-4),6.03 (2H,s,OCH2O),4.81 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-6),3.96 (3H,s,OCH3-10),3.11 (2H,t,J= 6.4Hz,H-5);13CNMR (CD3OD,125 MHz) δ:164.1 (C-9),151.2 (C-2),149.7 (C-3),145.1 (C-10),142.0 (C-8),140.8 (C-13a),134.4 (C-8a),129.5 (C-4a),129.2 (C-12a),126.0 (C-13),124.2 (C-12),121.8(C-1a),121.3 (C-11),109.1 (C-4) 106.3 (C-1),102.5 (OCH2O),61.1 (OCH3-10),57.1 (C-6),26.7 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致致，故鑒定為小檗紅堿。

化合物13白色針狀結晶(H2O)，易溶于水，微溶于甲醇，微溶于丙酮；mp.212～214 °C;ESI-MSm/z343 [M]+;[α]25 D-55 (c0.6,H2O);1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ:6.28 (1H,dd,J= 10.2,1.8 Hz,H-2),6.07 (1H,dd,J= 10.0,3.2 Hz,H-3),5.74 (1H,s,H-7),5.02 (1H,s,OH-5),4.99 (1H,d,J= 5.5 Hz,H-1′),4.66 (1H,d,J= 6.8 Hz,H-6),4.61 (1H,dd,J= 7.8,1.6 Hz,OH-4′),4.14 (1H,q,J= 5.3 Hz,OH-3′),4.06-4.12 (2H,m,H-4,5),3.74 (2H,J= 12.2,6.3,2.9 Hz,H-6′),3.49 (1H,dt,J= 11.7,5.8,5.8 Hz,H-6′),3.40 (3H,s,OCH3-4),3.28-3.38 (4H,m,H-2′,3′,4′,5′),3.21 (1H,m,OH-6′);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ:155.7 (C-1),138.6 (C-3),126.9 (C-2),117.6 (C-8),102.8 (C-1′),97.2 (C-7),77.4 (C-3′),77.0 (C-6),75.8 (C-5′),74.5 (C-5),73.5 (C-2′),70.7 (C-4),70.2 (C-4′),62.0 (C-6′),53.0 (OCH3-4)。該化合物碳譜與化合物11類似，僅多了一個甲基信號，其氫譜、質譜等數(shù)據(jù)與文獻[16,17]報道基本一致，故鑒定為bauhinin。

圖1 化合物12和13的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 12 and 13

2.2 活性數(shù)據(jù)

采用濾紙片瓊脂擴散法測定天葵子石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相及單體化合物的抑菌活性，如表1所示。結果表明，乙酸乙酯相和正丁醇相在載藥量為50 μg/片時對青枯病菌、獼猴桃潰瘍病菌、白菜軟腐病菌、魔芋軟腐病菌均有一定的抑菌效果，而石油醚相和水相抑菌效果較差。化合物7具有明顯的抑菌活性，載藥量為5 μg/片時對白菜軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌的抑菌圈直徑分別為19.4、13.3 mm；相同劑量下，化合物12對青枯病菌和獼猴桃潰瘍病菌的抑菌圈直徑分別為13.2 、12.8 mm。

表1 各相萃取物及化合物對4種細菌的抑菌效果Table 1 The antibacterial activity of fractions and obtained compounds on 4 species of bacteria

注：RS：青枯病菌；PS：獼猴桃潰瘍病菌；ECa：白菜軟腐病菌；ECb：魔芋軟腐病菌。

Note:RS:Ralstoniasolanacearum;PS:Pseudomonassyringaepv.Actinidiae;ECa:Erwiniacarotovorapv.Carotovora;ECb:Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(Jones) Bersey et al.

3 結論與討論

本研究對天葵子醇提物的化學成分進行了系統(tǒng)研究，從中分離得到13個化合物，并利用核磁共振波譜技術鑒定了其化學結構，主要為生物堿類、糖苷和小分子內(nèi)酯化合物。天葵子主要抑菌活性部位為乙酸乙酯相和正丁醇相，從正丁醇相分離得到的抑菌化合物為小檗堿 (7)和小檗紅堿 (12)，本研究對了解天葵子活性成分與農(nóng)用價值有一定的指導意義。