王 聰，王 坤，姜明國(guó)，譚學(xué)才，雷福厚，杜方凱，邱子言，孫坤來(lái)

1廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西高校食品安全與藥物分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2廣西高校微生物與植物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，南寧 530006；3浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，舟山 316022

海洋環(huán)境的特殊性造就了海洋放線菌種類及其次生代謝產(chǎn)物的多樣性，可能產(chǎn)生很多具有新穎骨架結(jié)構(gòu)、顯著生物活性的次生代謝產(chǎn)物，受到研究者的廣泛關(guān)注[1,2]。在對(duì)海洋藥物篩選的過(guò)程中，極有可能得到抗菌生物活性物質(zhì)。北部灣(廣西海域)是一個(gè)半封閉大海灣，具有豐富的海洋資源[3,4]。關(guān)于北部灣(廣西海域)在海洋沉積物微生物活性天然產(chǎn)物的研究鮮有報(bào)道。因此，從海洋放線菌中尋找抑菌劑具有很大的潛力，有望成為抗菌劑藥物研究的突破口。本實(shí)驗(yàn)用普通稀釋法，從采自廣西北部灣的黃槿、腐木和桐花樹(shù)等3種植物樣品和6個(gè)泥樣中分離獲得73株放線菌。對(duì)這些菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)TLC顯色、HPLC指紋圖譜分析和抗菌活性測(cè)試，篩選到一株鏈霉菌Streptomycessp.MDCW-126，鑒定其中一產(chǎn)物為星形孢菌素[5,6]，星形孢菌素是一種具有抗菌作用的吲哚咔唑類化合物[6]，經(jīng)對(duì)化合物1進(jìn)行了抑菌活性的測(cè)試，結(jié)果顯示化合物1對(duì)香蕉枯萎病菌的MIC值為10.0 μg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為125.0 μg/mL。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

黃槿、腐木、桐花樹(shù)和6個(gè)海泥樣品。樣品均于2017年11月采自廣西北部灣。

1.1.2 分離培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中添加的放線菌酮均為0.005%)

1.1.2.1 高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，KNO30.1%，K2HPO43H2O 0.05%，MgSO4.7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO40.001%， 瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.2 淀粉干酪素：干酪素0.2%，淀粉 1%，KH2PO43H2O 0.05%，MgSO4.7H2O 0.05%， 瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.3 葡萄糖-天冬酰胺：天冬酰胺0.05%，葡萄糖 1%，K2HPO43H2O 0.05%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.4 改良Emorson培養(yǎng)基:酵母浸粉0.1%，葡萄糖0.1%，蛋白胨0.4%，NaCl 0.4%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.5 精氨酸甘油：精氨酸0.1%，K2HPO43H2O 0.05%，甘油0.75%，麥芽浸粉1%，淀粉1%，MgSO4.7H2O 0.05%，丙酸鈉0.4%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.6 M2:甘油 0.75%，K2HPO43H2O 0.1%，精氨酸 0.1%，MgSO4.7H2O 0.05%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.7 M3:FeSO4.7H2O 0.001%，酪蛋白腺0.2%，天冬氨酸0.01%，丙酸鈉0.4%，甘油0.5%，K2HPO43H2O 0.05%，MgSO4.7H2O 0.01%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.8 1/10 ATCC 172：酵母浸汁0.5%，葡萄糖 1%，淀粉 2%，CaCO31.5%，水解干酪素 0.5%，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.9 酵母浸膏培養(yǎng)基：0.2% 酵母浸膏，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.10 牛肉浸膏培養(yǎng)基：0.2% 牛肉浸膏，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.11 海藻糖培養(yǎng)基：0.2%海藻糖，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.2.12 蛋白胨培養(yǎng)基：0.2% 蛋白胨，瓊脂2%，氯化鈉 3.3%。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

放線菌2號(hào)：可溶性淀粉2%，牛肉浸膏0.3%，蛋白胨1%，酵母浸膏1%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.05%，CaCO30.2%，氯化鈉3.3%。

放線菌A1培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%，蛋白胨0.2%，酵母浸膏0.4%，KBr 0.01%，F(xiàn)e2(SO4)3·4H2O 0.004%，CaCO30.1%，氯化鈉3.3 %。

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.2%，KNO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.05%， FeSO40.001%，氯化鈉 3.3%。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)菌株

抑菌活性實(shí)驗(yàn)采用2株致病菌：金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和香蕉枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense[3，4]。

1.1.5 試劑和儀器

HCB-1300V潔凈工作臺(tái)(青島海爾特種電器有限公司)、高壓滅菌鍋YXQ-LS-75SII型(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、生化培養(yǎng)箱LRH-500A型(廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司)、Agilent 1260 HPLC (美國(guó) Agilent 公司)、質(zhì)譜儀Mariner API-TOF型(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)、旋光儀POLAX-L型(美國(guó)ATAGO公司)、核磁共振儀Agilent-DD2 500型(Agilent公司)。

1.2 樣品預(yù)處理與菌株分離

植物樣品：取植物樣品1 g，在75%的酒精中浸泡5 min，采用無(wú)菌水沖洗后加入5 mL無(wú)菌水研磨，采用無(wú)菌水逐級(jí)梯度稀釋到10-2。泥土樣品：將海泥從冰箱拿出解凍，稱量海泥樣品1 g，加入5 mL無(wú)菌水逐級(jí)梯度稀釋到10-2。

采用普通稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行放線菌的分離，各取0.3 mL均勻涂布于分離培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)稀釋度涂布于3個(gè)平板，置于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。對(duì)分離出的菌株進(jìn)行純化，將純化好的菌株接入斜面培養(yǎng)基，存放于4 ℃冰箱，并保藏于含20%甘油的液體培養(yǎng)基中。每個(gè)樣品保藏4管，凍存管標(biāo)記上菌種保藏號(hào)及保藏日期，于-80 ℃冰箱保藏。

1.3 活性菌株的篩選

1.3.1 菌株發(fā)酵

將菌株接種于滅菌后的放線菌2號(hào)、放線菌A1和高氏I號(hào)培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28 ℃、轉(zhuǎn)速為180 rpm搖床培養(yǎng)。

1.3.2 菌株鑒定

對(duì)具有抗菌活性的MDCW-126菌株進(jìn)行鑒定，菌株基因組DNA的提取、擴(kuò)增以及測(cè)序純化由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用通用引物7F(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)、1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGC A-3′)，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。獲得的16S rDNA序列提交EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫(kù)，用軟件CMEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[4]。

1.3.3 浸膏提取

發(fā)酵液采用等體積的乙酸乙酯萃取3次，對(duì)乙酸乙酯萃取液進(jìn)行減壓濃縮得到粗浸膏。

1.3.4 抑菌活性測(cè)試

抑菌活性測(cè)試采用藥敏紙片法和二倍稀釋法[3,7,8]。將金黃色葡萄球菌均勻涂布到LB培養(yǎng)基(酵母浸膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%)上，香蕉枯萎病菌涂布到Y(jié)PD培養(yǎng)基(葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸膏1%，瓊脂2%)上。吸取10 μL樣品加入無(wú)菌濾紙片上，紙片干燥后貼于培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時(shí)間為12～24 h，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。致病菌真菌和細(xì)菌的陽(yáng)性藥分別是酮康唑和環(huán)丙沙星。對(duì)有分離得到的化合物采用二倍稀釋法測(cè)定其最小抑制濃度(MIC)。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌株的分離

采用普通稀釋法從黃槿、腐木，桐花樹(shù)以及6個(gè)海泥樣品中分離了73株放線菌，形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 分離獲得的菌株菌落培養(yǎng)照片F(xiàn)ig.1 Photograph of colony culture of the isolated strains

2.1.1 泥樣1(7株)：MDCW-80 、MDCW-95、MDCW-101、MDCW-114、MDCW-124、MDCW-140、MDCW-143。

2.1.2 泥樣2(2株)：MDCW-125、MDCW-142。

2.1.3 泥樣3(4株)：MDCW-118、MDCW-139、MDCW-141、MDCW-145。

2.1.4 泥樣4 (28株)：MDCW-73～75，MDCW-77、MDCW-81、MDCW-83、MDCW-87～93，MDCW-97、MDCW-102、MDCW-104～108、MDCW-110、MDCW-115～117、MDCW-132～134、MDCW-138。

2.1.5 泥樣5(4株)：MDCW-96、MDCW-99、MDCW-113、MDCW-135。

2.1.6 泥樣6(1株)：MDCW-112。

2.1.7 黃槿(3株)：MDCW-109、MDCW-129、MDCW-130。

2.1.8 腐木9(23株)：MDCW-76、MDCW-78～79、MDCW-82、MDCW-84～86、MDCW-94、MDCW-98、MDCW-100、MDCW-103、MDCW-111、MDCW-119～123、MDCW-126～127、MDCW-131、MDCW-136～137、MDCW-144。

2.1.9 桐花樹(shù)(1株)：MDCW-128。

結(jié)果表明：①在普通稀釋法中，未稀釋的樣品溶液分離得到的放線菌最多(圖2)；②從M2和M3培養(yǎng)基中分得的放線菌較多(圖3)，葡萄糖-天冬酰胺和精氨酸甘油培養(yǎng)基沒(méi)有放線菌長(zhǎng)出；③從不同樣品來(lái)看，泥樣4和腐木分離的放線菌數(shù)量較多(圖4)。

圖2 三種濃度分離的放線菌的數(shù)量Fig.2 Number of actinobacteria isolated by three concentrations

2.2 活性篩選

采用3種培養(yǎng)基分別對(duì)每株放線菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定其乙酸乙酯提取物(濃度為100 μg/mL)的抗菌活性。活性強(qiáng)弱根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)確定：如果抑菌圈的直徑<10 mm，表明有活性；抑菌圈的直徑在10～15 mm之間，定為中等活性；抑菌圈直徑>15 mm表明為強(qiáng)活性。結(jié)果表明：菌株MDCW-126在A1培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗金黃色葡萄球菌和香蕉枯萎病活性，菌株MDCW-78、MDCW-96、MDCW-107和MDCW-125在A1培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有中等程度抗金香蕉枯萎病活性(圖5)。菌株MDCW-103在A1培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物和菌株MDCW-114在高氏I培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗金黃色葡萄球菌。對(duì)菌株MDCW-126進(jìn)行初步研究。

圖3 不同培養(yǎng)基分離放線菌的數(shù)量Fig.3 Number of actinobacteria isolated on the different media

圖4 不同樣品分離的放線菌的數(shù)量Fig.4 Number of actinobacteria isolated from different samples

2.3 菌株鑒定

菌株MDCW-126的16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增序列的長(zhǎng)度為1469 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌株Streptomycesp.(Streptomycessanyensis219820)的16S rDNA基因序列同源性為96%，親緣關(guān)系最近、在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上處于同一分支。故將菌株MDCW-126(GenBank登錄號(hào)MK615749)初步鑒定為鏈霉菌Streptomycesp.(圖6)[4,9]。進(jìn)一步觀察其形態(tài)特征，菌落干燥，與培養(yǎng)基結(jié)合致密，與放線菌的鏈霉菌屬的形態(tài)特征相一致[7]。故鑒定菌株MDCW-126為鏈霉菌Streptomycesp.。

圖5 抗香蕉枯萎病的抑菌活性圖片F(xiàn)ig.5 Picture of anti-fusarium oxysporum f.sp.cubense activities

2.4 活性化合物的分離鑒定

對(duì)Streptomycessp.MDCW-126的放線菌A1培養(yǎng)基中的活性成分進(jìn)行分離，通過(guò)凝膠柱色譜分離，分離得到一個(gè)化合物，通過(guò)MS、NMR和比旋光度鑒定該化合物為星形孢菌素(圖7)[5，6]。

圖6 菌株MDCW-126鑒定Fig.6 Identification of strain MDCW-126

圖7 星形孢菌素的結(jié)構(gòu)式Fig.7 The chemical structure of staurosporin

3 結(jié)論

本研究采用普通稀釋法從廣西北部灣來(lái)源的海泥和植物樣品中分離并獲得73株放線菌。篩選出5株對(duì)香蕉枯萎病菌具有抑制作用的活性菌株、3株對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用的活性菌株，并從其中一株放線菌Streptomycessp.MDCW-126的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離鑒定了活性化合物——星形孢菌素。

目前，關(guān)于廣西北部灣海洋來(lái)源放線菌的研究主要是菌株的分離和鑒定，并未對(duì)菌株的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究[10,11]。本研究從廣西北部灣來(lái)源一株海洋放線菌Streptomycessp.MDW-06中分離到1個(gè)新的聚酮類化合物[4]，廣西北部灣蘊(yùn)含著有豐富的海洋生物資源[12]，是產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)、奇特活性藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。因此，從廣西北部灣海洋來(lái)源的放線菌中尋找新的生物活性化合物具有非常大的潛力，值得我們進(jìn)行深入研究。