李茜茜，李 飛，郎修遠，覃筱燕*

1中央民族大學生命與環(huán)境科學學院轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學中心，北京100081；2南寧市公安局強制隔離戒毒所，南寧 530001

何首烏Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.是蓼科何首烏屬植物，俗稱首烏。何首烏的活性成分主要包括二苯乙烯苷類、蒽醌類、酚類、黃酮類等。其中，2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4′-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)，俗稱二苯乙烯苷，為該藥用植物最主要的藥理活性成分，在該植物中的含量極高，同時藥理活性十分清晰，亦稱為何首烏苷(Polygonummultiflorumglycosides,PMG)[1-3]。近年來，對PMG(THSG或二苯乙烯苷)在神經(jīng)損傷保護方面的研究日漸增多，但其作用機理復雜多靶向，尚未闡明[1,2,4,5]。已發(fā)現(xiàn)的機制如通過維持神經(jīng)元內(nèi)的β-tubulin III 微管蛋白的形態(tài)構(gòu)成、調(diào)節(jié)caspase蛋白的表達量、抗氧化、提高腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)的活性等，從而提升腦損傷大鼠的學習記憶能力[1,2,5]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase B,TrkB)是神經(jīng)細胞內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導通路，它參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)，并在學習記憶中扮演著重要的角色。BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，主要分布于杏仁核、海馬、皮質(zhì)等部位[6]，是哺乳動物腦中分布最廣、含量最高的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它通過不同的途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活、分化和凋亡，對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的維持具有重要作用[7]。TrkB是BDNF的受體，二者結(jié)合后可觸發(fā)一系列細胞內(nèi)信號傳遞從而發(fā)揮生物學效應[8]。在BDNF/TrkB信號傳導通路中，BDNF與TrkB結(jié)合后激活胞內(nèi)區(qū)域，引起TrkB自身磷酸化作用增強，進而激活Ras-MAPK通路，最后在CAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)的絲氨酸位點激活CREB。CREB通過增加BDNF基因及抗凋亡蛋白基因Bcl-2的表達，促進神經(jīng)細胞生存，增加突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生[9]。因此BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路是腦細胞內(nèi)一條關(guān)鍵性的通路，尤其是維持細胞生存、抑制細胞凋亡的相關(guān)過程中起著十分重要的作用。本研究擬在前期工作基礎上[1,2]，通過神經(jīng)元原代培養(yǎng)并建立H2O2損傷模型，從細胞、分子水平觀察何首烏苷對神經(jīng)元氧化損傷及BDNF/TrkB信號通路的影響，探討何首烏苷對神經(jīng)元氧化應激損傷的拮抗作用，為臨床開發(fā)何首烏苷的藥用價值提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

何首烏苷(PMG)：2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號：B21757，規(guī)格：20 mg/支，HPLC法檢測其濃度≥98%。將何首烏苷用二甲基亞砜 (DMSO)溶解配置成濃度為1 μmol/L的溶液,于-20 ℃避光保存。使用時用蒸餾水配至所需濃度。

1.2 動物

實驗動物為新生24 h內(nèi)SD大鼠乳鼠，采購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，合格證號：SCXK(京)2016-0010；SYXK(京)2016-0041。

1.3 試劑

噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT貨號：M2128)、K252a(貨號：K1639)、POLY-L-Lysine 0.01%(貨號：RNBC5367)均購自Sigma公司； P-TrkB(貨號：4619S)、β-tubulin III(貨號：5568S)、DAPI(貨號：4083S)均購自Cell signaling 公司；BDNF(貨號：ab108319)購自Abcam公司；TUNEL(貨號：11684809910)購自Roche公司；DMEM/F-12(貨號：NYK0993)、胎牛血清(貨號：KSJ30472)均購自Thermo公司；Neuralbasal medium(貨號：1297830)、B27(貨號：1268476)均購自Invitrogen公司；胰蛋白酶(貨號：20130506)、青霉素鏈霉素混合液(貨號：20130410)均購自北京索萊寶科技有限公司；Tween-20(貨號：922C042)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司)、熒光/吸收光酶標儀(美國Thermo公司)、高速冷凍離心機5417R(德國Eppendodf 公司)、Odyssey CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.5 實驗方法[1,11]

1.5.1 神經(jīng)元原代培養(yǎng)及實驗分組

無菌環(huán)境下取SD大鼠乳鼠的海馬體剪碎，用0.25%胰蛋白酶在37 ℃下消化25 min，用含10%胎牛血清的DMEM液終止消化并吹打均勻，用100目過濾篩除去未消化組織塊，1 100 rpm離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM液重懸成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，接種到細胞板上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后培養(yǎng)基更換為含B27的Neurobasal?培養(yǎng)基，每隔2 d半量換液一次，細胞培養(yǎng)5～7天，生長狀態(tài)良好[1,11]。實驗時將細胞隨機分為7組:control組、H2O2模型組、K252a組、K252a+H2O2組、PMG+ H2O2預處理組、PMG+K252a+H2O2組和PMG組。Control組不加任何藥物處理；H2O2模型組加入終濃度為200 μmol/L的H2O2；K252a組加入終濃度為200 nM的K252a；K252a+H2O2組加入終濃度為200 nM的K252a和200 μmol/L的H2O2；PMG+ H2O2組預先加入終濃度分別為100、200、400 μmol/L的PMG預處理2 h后再加入終濃度為200 μmol/L的H2O2；PMG+K252a+ H2O2組預先加入終濃度分別為200 μmol/L的PMG和200 nM的K252a預處理2 h后再加入終濃度為200 μmol/L的H2O2；PMG組分別加入終濃度為100、200、400 μmol/L的PMG。各實驗組處理后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，20～24 h后用于實驗[1,10]。

1.5.2 MTT法測定細胞存活率

培養(yǎng)在96孔板里的細胞經(jīng)藥物處理20～24 h后，吸出培養(yǎng)基，PBS輕洗1～3次，每孔加入100 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT，培養(yǎng)箱孵育2～4 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，搖床上震蕩10 min，待顆粒溶解后，在波長為560 nm處測定吸光度A值。細胞存活率(100%)=待測組A值/control組A值×100%，設定control組細胞存活率為100%，細胞的存活率與A值成正比。

1.5.3β-Tubulin III染色、DAPI染色以及TUNEL染色

造模、給藥與細胞培養(yǎng)均與前面實驗相同。對各實驗組分別進行β-tubulin Ⅲ、DAPI及TUNEL免疫熒光染色，取出生長在24孔板蓋玻片上的SD大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元細胞，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定PBS洗滌；用一抗β-tubulin Ⅲ(1∶1 000)、二抗以及DAPI熒光染色，PBS 洗滌，封片，通過熒光顯微鏡分別觀察各實驗組細胞毒性損傷時的細胞骨架、核形態(tài)及凋亡分布變化。

1.5.4 Western blot 檢測目的蛋白表達量

培養(yǎng)在6孔板里的細胞藥物處理20～24 h后，用0.01 mol/L的PBS洗滌3～5次，每孔加入100 μL的細胞裂解液，冰上靜置30 min，12 000 rpm的高速冷凍離心15 min，取上清液。用BCA法測定蛋白濃度，10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，5%的脫脂奶粉封閉30 min，一抗(1∶1 000)4 ℃ 孵育過夜，用TBST洗3～5次，在室溫下二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST洗3～5次，加化學發(fā)光液(A液與B液等體積混合)在化學發(fā)光成像儀Tanon4200下觀察蛋白質(zhì)的表達量并拍照。

1.6 統(tǒng)計學分析方法

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測PMG對H2O2誘導神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用

培養(yǎng)至7天，向神經(jīng)元培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的H2O2(50、100、150、200、250、300、400 μmol/L)，細胞繼續(xù)培養(yǎng)1天。MTT檢測的實驗數(shù)據(jù)表明，各濃度H2O2損傷組細胞存在不同程度的損傷，且隨著H2O2濃度的提高，細胞存活率呈濃度依賴性的下降，分別為74.62%、58.37%、50.63%、46.81%、31.93%、17.48%、9.36%，表明神經(jīng)元損傷模型的建立。選擇H2O2濃度為200 μmol/L時，細胞存活率為46.81%，作為后續(xù)實驗最佳H2O2損傷濃度。

為進一步明確PMG的最佳保護作用及毒性濃度，實驗設置8個小組，分別為對照組、H2O2損傷組(終濃度200 μmol/L)、PMG不同濃度組(終濃度分別為100、200、400 μmol/L)和PMG不同濃度預處理組，進行MTT檢測。實驗結(jié)果如表1所示，與H2O2損傷組相比，終濃度分別為100、200 μmol/L的PMG預處理，神經(jīng)元存活率大幅度上升(69.80%，93.63% 和P<0.05，P<0.001)，說明一定濃度范圍的PMG對于H2O2誘導的神經(jīng)元氧化應激損傷具有保護作用。與對照組相比，終濃度分別為100、200 μmol/L的PMG對神經(jīng)元存活沒有影響，而PMG終濃度達到400 μmol/L時，細胞的存活率已經(jīng)下降到57.82%，說明過高濃度的PMG對神經(jīng)細胞可產(chǎn)生毒性，因此，PMG在做保護性藥物時，應合理控制PMG的濃度范圍，選擇最佳保護濃度。

2.2 TUNEL染色顯示PMG對H2O2氧化應激誘導神經(jīng)元凋亡的抑制

培養(yǎng)7天的細胞采用TUNEL和DAPI染色法觀察細胞凋亡率的變化。結(jié)果如圖1、2顯示，DAPI染色正常細胞核呈圓形或橢圓形、淺藍色；TUNEL染色凋亡細胞核呈強熒光綠色，為大小不均的點狀，細胞核固縮或溶解成碎片。對照組正常培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的TUNEL檢測顯示無強熒光染色，綠色的細胞凋亡數(shù)極少。H2O2損傷組神經(jīng)元表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)特征：為強熒光綠色，細胞核固縮或溶解成碎片，凋亡率顯著提高。濃度為200 μmol/L PMG預先處理的大鼠海馬神經(jīng)元，核固縮細胞的數(shù)目或核溶解成碎片明顯減少，統(tǒng)計顯示PMG+ H2O2預處理組的細胞凋亡率與H2O2損傷組相比下降24%(P<0.01)，具有統(tǒng)計學意義；另外，PMG組顯示的TUNEL和DAPI染色結(jié)果排除了PMG對細胞具有毒性作用。TUNEL染色結(jié)果顯示PMG可拮抗H2O2誘導的神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學變化。

表1 不同濃度PMG對H2O2誘導神經(jīng) 元毒性損傷細胞存活率的影響Table 1 Effect of different concentrations of PMG on H2O2- induced neuronal toxicity in cell

注：*與Control組比較，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001；#與H2O2損傷組比較，#P<0.05；##P<0.01;###P<0.001。

Note:*Compare with control,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001；#Compare with H2O2injury group,#P<0.05；##P<0.01;###P<0.001.

圖1 TUNEL檢測顯示PMG對H2O2誘導的神經(jīng)元凋亡的影響Fig.1 Effect of PMG on H2O2-induced neuronal apoptosis induced by TUNEL staining

2.3 BDNF/TrkB信號通路激活參與PMG對H2O2誘導神經(jīng)元氧化應激損傷的保護

2.3.1 MTT法檢測BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑K252a對細胞存活率的影響

細胞培養(yǎng)至7天，生長狀態(tài)良好，在PMG預處理組神經(jīng)元培養(yǎng)基中預先加入BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑K252a 2 h后，再按照前文所述的類似步驟進行加藥物和MTT檢測。MTT檢測結(jié)果如圖3所示：與對照組相比，K252a組細胞存活率沒有明顯下降；與PMG+H2O2預處理組相比較，當加入K252a后，PMG+H2O2+ K252a組神經(jīng)元細胞的存活率大幅度下降(P<0.01)，PMG失去了原有的保護作用，說明PMG的保護作用與BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路激活密切相關(guān)，推測PMG通過上調(diào)BDNF及其磷酸化受體TrkB的表達發(fā)揮其保護作用。

2.3.2β-Tubulin III染色顯示PMG和K252a對細胞骨架形態(tài)的影響

培養(yǎng)7天的細胞用β-tubulin III進行熒光染色標記，能反映不同實驗組神經(jīng)細胞骨架形態(tài)的變化。β-Tubulin III陽性染色為綠色網(wǎng)狀細胞突起，較好地顯示細胞骨架的形態(tài)。我們的實驗結(jié)果從圖4中看出，對照組正常神經(jīng)元軸、樹突細長和密集，排列有序，交織成網(wǎng)絡；H2O2損傷組β-tubulin III陽性神經(jīng)元顯著減少，被β-tubulin III標記的突起稀少和不同程度的斷裂彎曲，排列紊亂，不形成網(wǎng)絡。而經(jīng)過PMG+ H2O2預處理組的神經(jīng)元骨架形態(tài)保持相對完整，說明PMG可以通過維護神經(jīng)元內(nèi)微管蛋白β-tubulin III的正常形態(tài)及表達來有效抑制H2O2誘導的神經(jīng)元骨架形態(tài)損傷。與PMG+H2O2預處理組相比，加入BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑K252a，PMG+H2O2+K252a組細胞骨架顯示損傷狀態(tài)，PMG失去了原有的維護神經(jīng)元骨架形態(tài)完整性的作用，說明PMG維護神經(jīng)元骨架的正常形態(tài)與BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路激活相關(guān)。

圖2 不同處理組量化的凋亡細胞 百分率(TUNEL陽性細胞)統(tǒng)計圖Fig.2 Statistics of percentage of apoptotic cells (TUNEL positive cells) quantified by different treatment groups注：*與Control組相比較，*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001。Note:*Compare with control,*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001.

圖3 K252a逆轉(zhuǎn)PMG對H2O2誘導神經(jīng)元氧化 應激損傷細胞存活率的影響(n=6)Fig.3 Effect of K252a reversal of PMG on H2O2-induced neuronal oxidative stress-induced cell viability (n=6)注：*與H2O2損傷組比較，*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001；#與PMG+H2O2組相比較， #P<0.05； ##P<0.01;###P<0.001。Note:* Compare with the H2O2 injury group,*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001； # compare with PMG+H2O2 group, #P<0.05； ##P<0.01;###P<0.001.

圖4 β-tubulin Ⅲ染色觀察PMG和K252a對H2O2誘導神經(jīng)元損傷細胞骨架形態(tài)的影響(10×20)Fig.4 Effect of PMG and K252a on the cytoskeleton morphology of H2O2-induced neuronal injury by β-tubulin III staining (10×20)注:β-tubulin Ⅲ 顯示為綠色細胞突起。Note:β-tubulin III shows green cell protrusion.

2.3.3 Western blot檢測PMG對H2O2誘導神經(jīng)元氧化應激損傷中BDNF和P-TrkB蛋白表達量的影響

通過Western blot法對不同處理組BDNF和其磷酸化TrkB蛋白表達量的檢測如圖5顯示，與正常對照組相比，H2O2處理組BDNF和P-TrkB表達下降；而PMG+H2O2預處理組扭轉(zhuǎn)了H2O2處理組引起的BDNF和P-TrkB表達量的下降 (P<0.001)；加入BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑K252a后，PMG+H2O2+K252a處理組BDNF和P-TrkB表達下調(diào)(P<0.01)。實驗結(jié)果表明：加入K252a后，通過MTT和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)PMG原有的保護作用失效，BDNF和P-TrkB表達下降(P<0.01)，由此推測，BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路介導了PMG對H2O2誘導的神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用， BDNF是該過程中的重要因子，BDNF可能通過調(diào)控下游信號分子蛋白的表達來實現(xiàn)這一作用的。

圖5 Western blot法檢測PMG對H2O2誘導神經(jīng)元損傷中BDNF蛋白表達量的影響(n=5)Fig.5 Western blot assay for the effect of PMG on the expression of BDNF protein in H2O2-induced neuronal injury (n=5)注：A為Western blot法檢測BDNF和P-TrkB蛋白表達，B、C為光密度統(tǒng)計分析結(jié)果。*與H2O2損傷組比較,***P<0.001； #與PMG+H2O2組比較, ##P<0.01。Note:A is the Western blot method for the detection of BDNF and P-TrkB protein expression,B and C are the results of optical density statistical analysis.*Compared with the H2O2 injury group,***P<0.001;#Compared with the PMG+H2O2 group,##P<0.01.

3 討論

氧化應激是目前神經(jīng)損傷研究的一個熱點方向，其主要機理是有害刺激引起機體氧化-抗氧化之間的失衡，ROS大量積累，造成鈣穩(wěn)態(tài)的失調(diào)、細胞色素C的過量釋放以及脂類的過氧化，造成神經(jīng)細胞的死亡[11,12]。研究表明，阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)[13]等神經(jīng)退行性疾病都與氧化應激損傷有關(guān)。過氧化氫(H2O2)是氧化應激模型常用的損傷藥物，通過氧化應激作用可能誘導多種細胞的凋亡[11]。

BDNF/TrkB信號通路與神經(jīng)發(fā)生、發(fā)育以及疼痛密切相關(guān)，而且參與抑郁癥等神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展，BDNF/TrkB控制著下游多個信號轉(zhuǎn)導通路的表達[14,15]，在AD患者大腦海馬和皮質(zhì)內(nèi)BDNF的mRNA水平和蛋白質(zhì)含量都有降低，提示BDNF可能與AD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[14]。正常老化和AD患者腦中磷酸化TrkB的表達也減少[16]。BDNF與高親和力的TrkB結(jié)合后可以激活MEK/ERK/RSK、PI3K/Akt和Ca2+/CAM/CAMK信號通路[17]，誘導CREB磷酸化，從而激活BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)錄[18]，促進突觸可塑性、增加神經(jīng)元活性及神經(jīng)發(fā)生[9]。k252a 是一種特異性TrkB的抑制劑，能使 TrkB受體不能磷酸化而發(fā)揮作用，阻斷了BDNF/TrkB 信號傳導通路[19]。因此，在研究中常配合相關(guān)藥物使用該抑制劑，結(jié)合實驗結(jié)果驗證藥物發(fā)揮作用是否是通過影響B(tài)DNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)。

本研究中，我們在前期研究工作基礎上，將原代培養(yǎng)的1日齡SD大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元與H2O2培養(yǎng)一段時間后進行MTT檢測，并采用TUNEL法觀察細胞凋亡的形態(tài)改變。結(jié)果表明，與對照組相比，H2O2可以誘導神經(jīng)元損傷，而與H2O2損傷組相比，PMG預處理組細胞存活率升高而凋亡細胞數(shù)量明顯較少，說明了PMG對H2O2誘導大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元氧化應激損傷具有一定的保護作用。為進一步探討B(tài)DNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路對PMG保護作用的影響，本實驗向細胞培養(yǎng)基中加入BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路阻斷劑K252a，并使用MTT、β-tubulin Ⅲ熒光染色和Western Blot法等進行相關(guān)的檢測。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，K252a組細胞存活率沒有明顯下降；與PMG+H2O2預處理組相比較，當加入K252a后，MTT檢測PMG+H2O2+K252a組神經(jīng)細胞存活率大幅度下降(P<0.01)，β-tubulin Ⅲ熒光染色顯示細胞骨架形態(tài)呈損傷狀態(tài)，PMG失去了原有的保護作用；同時，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)PMG預處理組能逆轉(zhuǎn)H2O2損傷神經(jīng)元的BDNF和P-TrkB表達量下調(diào)(P<0.001)，當加入K252a后，PMG+ H2O2+K252a處理組BDNF和P-TrkB表達明顯下調(diào)(P<0.01)。實驗結(jié)果表明，PMG的保護作用與BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導通路激活密切相關(guān)。PMG可以阻止H2O2氧化應激誘導的BDNF和磷酸化的受體TrkB表達量的下降，BDNF是該過程中的重要因子。

綜上所述，PMG對H2O2誘導的大鼠海馬神經(jīng)元氧化應激損傷具有拮抗作用，其機制可能是通過激活BDNF/TrkB通路，上調(diào)BDNF及其磷酸化的受體TrkB表達量，維護神經(jīng)元骨架的正常形態(tài)得以實現(xiàn)，實驗結(jié)果為臨床使用以及進一步開發(fā)何首烏苷的藥用價值提供了參考。