居博偉，楊建華，胡君萍

1新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊830000；2新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊830054；3新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830011

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以進行性記憶減退、認知功能障礙為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-3]。目前較為公認的β淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)反應假說認為，生理狀態(tài)下的正常代謝產(chǎn)物Aβ1-42和Aβ1-40單體本無神經(jīng)毒性，但當其遇到APP外源介質(zhì)影響導致異常沉積后，積聚的Aβ1-42形成可溶性Aβ寡聚體(ADDLs)，阻止單體產(chǎn)生保護活性從而引起神經(jīng)元變性、突觸丟失和軸突損傷，最終引發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡致癡呆，因此考察其關鍵靶標Aβ1-42和Aβ1-40蛋白在腦內(nèi)表達情況對于肉蓯蓉苯乙醇苷防治的AD研究具有重要的意義[4-7]。同時，研究AD動物模型腦內(nèi)特征性病變部位海馬各分區(qū)的組織病理學檢測可從宏觀上真實反映藥物對其腦內(nèi)病變部位的改善情況[8-10]。

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥認為補腎益精類中藥肉蓯蓉具有抗老防衰、改善記憶的功效[11-14]。大量前期研究已證實，肉蓯蓉苯乙醇總苷及苯乙醇苷代表性單體-毛蕊花糖苷在傳統(tǒng)方法構建的AD在體或離體模型中均表現(xiàn)出明顯的拮抗AD作用，具有一定的防治神經(jīng)退行性疾病的潛能[15-20]。但未見肉蓯蓉苯乙醇苷應用APP/PS1雙轉基因模型從β淀粉樣蛋白角度開展防治AD作用研究。

綜上所述，本研究基于AD發(fā)病機制研究中經(jīng)典假說—Aβ級聯(lián)反應假說，借助理想、可靠的AD動物模型APP/PS1雙轉基因小鼠作為體內(nèi)研究平臺，采用Morris水迷宮、HE染色法、Western-blot、免疫組化等先進技術手段，從動物行為學、組織病理學角度、分子生物學層面考察肉蓯蓉苯乙醇苷對APP/PS1雙轉基因小鼠腦部海馬區(qū)β淀粉樣蛋白表達的影響，以期尋找AD防治新靶點，為肉蓯蓉苯乙醇苷防治AD具體作用機制的研究提供參考依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

肉蓯蓉苯乙醇總苷(課題組自制，苯乙醇總苷含量達87.6%)；毛蕊花糖苷(批號111530-200505，中檢所)；二氧化鈦(批號20161025，上海染料研究所有限公司)；HE染色試劑盒(批號20160902，凱基生物公司)；中性樹膠(批號20161208，上海懿詳公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號1043721，北京索萊寶公司)；BCA蛋白定量試劑盒(批號20150323，南京凱基生物公司)；Aβ1-40(批號20161012，美國CST公司)；Aβ1-42(批號20161014，美國CST公司)；β-actin(批號20161012，美國CST公司)；堿磷酶標記兔抗山羊IgG(H+L)(批號20162308，北京中杉金橋公司)；4×蛋白上樣緩沖液含β-巰基乙醇(批號2010662，北京索萊寶公司)；10×TBST(批號20160611，北京索萊寶公司；PVDF膜(批號03010040001，瑞士羅氏公司)；SDS(批號20160930，北京索萊寶公司)；Tris(批號WXBB4339V，美國VETEC公司)；甘氨酸(批號GB10466，北京索萊寶公司)；脫脂奶粉(批號WB20361，美國BD公司)；BCIP/NBT Kit(美國invitrogen公司)；二抗(批號15922207，北京中杉金橋公司)；吐溫20(批號WXRC6526N，美國VETEC公司)。

1.2 動物

6月齡APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠60只及同窩陰性小鼠10只，雌雄對半，體質(zhì)量20±10 g，中國江蘇南京模式動物研究所，許可證號[SCXK(蘇)2015-0001]，實驗過程中動物自由攝食和飲水。

1.3 儀器

MT-100 Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；RM2016病理切片機(德國Leica公司)；SIM-F124型制冰機(日本SANYO公司)；凝膠電泳及轉膜設備(美國BIO-RAD公司)；全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；4°C和-20°C冰箱(青島海爾公司)；67120超純水儀(美國Millipore公司)；TP-114電子天平(北京Sartorius公司)；低溫冷凍高速離心機(美國Thermo Scientific公司)；DVKW-D-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；超聲波細胞破碎儀(寧波新芝公司)；WD-9405A型脫色搖床(北京六一儀器廠)；可調(diào)式恒壓恒流電源(美國BIO-RAD公司)；DM4000熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

依據(jù)SPSS18.0統(tǒng)計軟件產(chǎn)生的隨機數(shù)字，將AD模型小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組(每日灌胃劑量為0.65 mg/kg)、肉蓯蓉苯乙醇總苷(PhGs)高、中、低劑量組(每日灌胃劑量分別為250、125、62.5 mg/kg)、肉蓯蓉毛蕊花糖苷干預組(125 mg/kg)，每組10只。于6月齡時開始對小鼠按組別實施灌胃治療，連續(xù)3個月，每日灌胃1次。正常組為同窩非轉基因小鼠，模型組和正常組給予等體積蒸餾水灌胃。

2.2 Morris水迷宮實驗

采用經(jīng)典的Morris水迷宮測試小鼠空間學習及記憶能力。第1、2天訓練小鼠熟悉平臺位置，練習尋找平臺，第3～5天進行正式測試，觀察各組小鼠訓練后尋找平臺的情況，第6天撤去平臺，觀察小鼠的游泳軌跡。實驗過程中，攝像頭會同步記錄小鼠尋找平臺花費時間(即逃避潛伏期)及游泳軌跡的距離。若小鼠在設定的時間范圍內(nèi)未找到平臺(一般設定為60 s或120 s，本實驗采用60 s)，則將該小鼠的逃避潛伏期記為設定值，且由工作人員將其置于平臺上停留數(shù)秒(本實驗釆用10 s)，助其加深平臺記憶。實驗結束后，記錄小鼠從入水開始直至找到平臺的游泳時間。在實驗的最后一天，撤去平臺，設定時間內(nèi)需要記錄的內(nèi)容主要有小鼠穿越平臺次數(shù)、目標象限的停留時間等，分析每個實驗動物的搜索策略。

2.3 腦組織取材及石蠟包埋

給藥結束后稱重小鼠，使用10%水合氯醛麻醉小鼠。將麻醉后的小鼠仰放在操作臺上固定四肢。4%多聚甲醛內(nèi)灌注固定后處死動物，剔除小腦等多余的腦組織，沿大腦半球末尾，除去整個小腦和大腦中部冠狀面前半部分。4%多聚甲醛中固定24 h，超純水清洗10 分鐘后依次放入30%乙醇(1 h)→40%乙醇(1 h)→50%乙醇(1 h)→75%乙醇(1 h)→90%乙醇(1 h)→95%乙醇(1 h)→無水乙醇I(1 h)→無水乙醇II(1 h)→二甲苯I(15 min)→二甲苯II(15 min)。浸入石蠟2 h，組織包埋后在小鼠腦部海馬CA1區(qū)連續(xù)冠狀切片。于60 ℃烘箱內(nèi)干燥48 h后常溫保存。

2.4 HE染色

將每組選取的切片于60 °C烘箱內(nèi)烤片40 min，然后依次將其放入二甲苯I(5 min)→二甲苯II(10 min)→無水乙醇(5 s)→95%乙醇I(5 s)→95%乙醇II(5 s)→80%乙醇(5 s)→蒸餾水沖洗多次，使用HE染色試劑盒染色后中性樹膠封片。

2.5 免疫組織化學染色

將制備完成的切片按照脫蠟、抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、封片的標準步驟進行免疫組化染色。每組選取適宜6張切片，電鏡下觀察神經(jīng)元細胞形態(tài)、著色，使用Image J軟件計數(shù)海馬陽性細胞數(shù)值。

2.6 Western blot分析蛋白表達情況

吸取組織上清液按照BCA蛋白定量法測定從腦組織海馬中提取的蛋白含量。與4×蛋白上樣緩沖液按照4:1的比例混勻，95 °C加熱10 min，自然冷卻后于-20 °C冰箱內(nèi)保存。制備SDS-PAGE凝膠，加入電泳液后依次加入正常組、藥物干預組等各組蛋白，兩側膠孔加入蛋白Marker。冰浴盒中電泳至分離膠底部終止電泳。轉膜液平衡后依據(jù)膠大小剪取PVDF膜、濾紙。在轉膜夾中按照黑色纖維墊→3層濾紙→凝膠→PVDF膜→3層濾紙→黑色纖維墊組裝，清除氣泡后80 V恒壓轉膜。轉膜完成后脫脂牛奶封閉2 h。稀釋抗體加入對應膜中孵育過夜。二抗孵育2 h后加入BCIP/NBT顯色液直至顯色。BIO-RAD凝膠成像儀采圖。用Image J軟件定量分析目的蛋白條帶，以IOD表示蛋白條帶的相對強弱。結果以目的蛋白與對照蛋白β-actin的積分光密度值的比值表示。結果以(目標蛋白ID/內(nèi)參ID)×100%表示。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

3 實驗結果

3.1 Morris水迷宮檢測結果

隨著訓練時間的不斷增加，各組小鼠到達平臺的時間(逃避潛伏期)明顯縮短。第1，2天為訓練時間，第3天模型組與正常對照組小鼠相比逃避潛伏期顯著延長(P<0.01)；第4天、第5天模型組小鼠逃避潛伏期與正常對照組小鼠相比明顯延長(P<0.05)；第3天多奈哌齊組小鼠逃避潛伏期與模型組相比顯著縮短(P<0.05)；與模型組相比，肉蓯蓉苯乙醇總苷各劑量組、毛蕊花糖苷組隨著劑量的增加，小鼠逃避潛伏期明顯縮短，具有顯著差異(P<0.05)(見表1)。

表1 肉蓯蓉苯乙醇苷對APP/PS1雙轉基因小鼠逃避潛伏期的影響Table 1 Effects of phenylethanoid glycosides on the escape latency of APP/PS1 double transgenic

注：與正常組比較，##P< 0.01，#P< 0.05；與模型組比較，**P< 0.01，*P< 0.05。

Note：Compare with control,##P<0.01，#P<0.05；compare with model,**P<0.01，*P<0.05.

水迷宮實驗第6天撤去平臺進行空間探索實驗，記錄60 s內(nèi)各組小鼠穿越平臺位置的次數(shù)。由結果可得，模型組小鼠在設定時間內(nèi)穿越平臺次數(shù)與正常組小鼠相比顯著減少(P<0.01)；與模型組相比，肉蓯蓉苯乙醇總苷各劑量組及毛蕊花糖苷組穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)，具有顯著性差異(見表2)。上述研究結果均暗示肉蓯蓉苯乙醇苷可以顯著改善APP/PS1雙轉基因AD小鼠的學習記憶能力，并且具有一定的劑量依賴性。

組別Group穿越平臺次數(shù)Number of times past the platform正常組Control3.20±0.45模型組Model1.75±0.50##多奈哌齊組donepezil3.25±0.89**肉蓯蓉苯乙醇總苷高劑量組PhGs-H4.44±1.01**肉蓯蓉苯乙醇總苷中劑量組PhGs-M3.56±0.53**肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組PhGs-L2.75±0.71*毛蕊花糖苷組Acteoside3.26±0.88**

注：與正常組相比，##P< 0.01，#P<0.05；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

Note：Compare with control,##P<0.01，#P<0.05；compare with model,**P<0.01，*P<0.05.

3.2 病理組織染色觀察結果

結果可知，正常組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列整齊緊密，分布較為均勻，層次清晰，椎體細胞核較大且性狀近似圓形。而模型組小鼠海馬CA1區(qū)由于受到損傷，導致神經(jīng)元細胞和形態(tài)發(fā)生明顯改變，排列疏松混亂，無明顯層次，細胞之間的連接松散，部分細胞核出現(xiàn)固縮、凋亡，使染色偏深。肉蓯蓉苯乙醇苷不同劑量干預組、多奈哌齊組和毛蕊花糖苷干預組海馬CA1區(qū)細胞均有不同程度的改善，固縮、深染的神經(jīng)元細胞較模型組明顯減少，但仍可看到較大的細胞間隙(見圖1)。

3.3 免疫組化實驗結果

肉蓯蓉苯乙醇苷治療后，取9月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠腦部組織切片，對其海馬CA1區(qū)進行Aβ1-40免疫組化染色，結果顯示：視野內(nèi)可見陽性細胞多呈圓形，大部分是胞膜著棕黃色，與正常組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-40陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，肉蓯蓉苯乙醇總苷高、中劑量組和毛蕊花糖苷組陽性細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，多奈哌齊組和肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組Aβ1-40陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，具有顯著性差異(見表3，圖2)。

經(jīng)肉蓯蓉苯乙醇苷干預后，取9月齡的APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織切片，對其海馬CA1區(qū)進行Aβ1-42免疫組化染色，結果顯示：與模型組比較，肉蓯蓉苯乙醇總苷各劑量組和毛蕊花糖苷組陽性細胞數(shù)顯著減少，具有顯著性差異(P<0.01)(見表4，圖3)。

3.4 Western-blot檢測結果

Western-blot法檢測小鼠海馬Aβ1-40、Aβ1-42蛋白的表達，結果表明，模型組小鼠海馬Aβ1-40、Aβ1-42的蛋白表達較正常組明顯上調(diào)，有顯著性差異(P<0.05)。肉蓯蓉苯乙醇苷各劑量干預組和毛蕊花糖苷干預組小鼠海馬Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表達較模型組小鼠均顯著下調(diào)(P<0.01)，具有顯著性差異(P<0.01)，見圖4。

圖1 各組小鼠海馬CA1區(qū)病理組織切片染色(HE染色，×200)Fig.1 Histopathological section staining of hippocampal CA1 region of mice in different groups (HE staining,×200)注：A為正常組，B為模型組，C為多奈哌齊組，D為肉蓯蓉苯乙醇總苷高劑量組，E為肉蓯蓉苯乙醇總苷中劑量組， F為肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組，G為毛蕊花糖苷組。Note：A is Control,B is Model,C is donepezil,D is PhGs-H,E is PhGs-M,F is PhGs-L,G is Acteoside.

表3 海馬CA1區(qū)Aβ1-40陽性神經(jīng)細胞數(shù)目Table 3 The number of Aβ1-40 positive neurons in CA1 region of

注：與正常組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

Note：Compare with control,##P<0.01，#P<0.05；compare with model,**P<0.01，*P<0.05.

4 結論

AD主要發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，由多因素誘導產(chǎn)生，到目前為止其發(fā)病機制尚不明了，但研究核心仍然圍繞Aβ展開。作為腦內(nèi)APP分泌的主要多肽，Aβ1-42和Aβ1-40的異常沉積并不能直接引起神經(jīng)元的變性，從病源的角度來講，Aβ1-42產(chǎn)生的可溶性寡聚體ADDLs才是導致腦內(nèi)神經(jīng)元變性的真正誘因。但對這兩種蛋白表達的考察也可以實時反映AD腦內(nèi)病變程度，間接顯示可溶性寡聚體ADDLs的表達情況，進而從源頭動態(tài)監(jiān)測腦內(nèi)神經(jīng)元損傷狀況，為疾病防治提供參考。也鑒于此，Aβ1-42和Aβ1-40已成為AD發(fā)病機制研究中的關鍵靶標。

海馬作為腦內(nèi)評價學習記憶能力優(yōu)劣的主要作用部位，其神經(jīng)元的損傷是AD產(chǎn)生認知功能障礙的主導誘因，而海馬CA1區(qū)是AD病理損傷的主要部位之一，本部分實驗采用HE染色法，結果發(fā)現(xiàn)正常組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列整齊緊密，分布較為均勻，層次清晰。而模型組小鼠海馬CA1區(qū)因損傷出現(xiàn)神經(jīng)元細胞凋亡等退行性改變，經(jīng)肉蓯蓉苯乙醇苷不同劑量組干預后，其海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)均有不同程度的改善，提示肉蓯蓉苯乙醇苷可能具有保護神經(jīng)元、抑制其凋亡的作用，但由于HE染色對于細胞凋亡和神經(jīng)元丟失并無特異性，后期仍需要針對凋亡特異分子標志物進行相關檢測。

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-40染色(免疫組化，×200)Fig.2 The expressions of Aβ1-40 in hippocampus CA1 of mice in different groups(immunohistochemical method,×200)注：A為正常組，B為模型組，C為多奈哌齊組，D為肉蓯蓉苯乙醇總苷高劑量組， E為肉蓯蓉苯乙醇總苷中劑量組，F(xiàn)為肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組，G為毛蕊花糖苷組。Note：A is Control,B is Model,C is donepezil,D is PhGs-H,E is PhGs-M,F is PhGs-L,G is Acteoside.

表4 海馬CA1區(qū)Aβ1-42陽性神經(jīng)細胞數(shù)目Table 4 The number of Aβ1-42 positive neurons in CA1 region of

注：與正常組相比，##P<0.01，#P<0.05；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

Note：Compare with control,##P<0.01，#P<0.05；compare with model,**P<0.01，*P<0.05.

HE染色法是組織病理學考察的經(jīng)典方法，對待測組織的前處理直接關系到染色結果。實驗中作者發(fā)現(xiàn)，由于轉基因小鼠海馬位于端腦顳葉的內(nèi)側深部，體積較小，組織分離難度較大，稍有不慎就會對其造成機械損傷，從而無法有效觀察其病理改變。同時，因轉基因小鼠價格昂貴，且實驗給藥周期較長，樣本一旦損失可能影響研究的整體進度。因此，當小鼠完成心臟灌注后，全腦取出使用多聚甲醛固定，手術刀片除去嗅球部分，其余腦組織全部進行脫水、包埋步驟，切片厚度控制在3～5 μm，在保證海馬體完整的前提下優(yōu)化了操作流程，提高了研究效率。

在Western-blot檢測中作者發(fā)現(xiàn)，由于Aβ1-42和Aβ1-40蛋白分子量較小，使表達條帶不易印跡，因而需要對其SDS-PAGE凝膠濃度、電泳時間和轉膜時間進行篩選。分離膠濃度過小會導致電泳泳道遷移，蛋白激活不完全；電泳時間過長會導致條帶偏移出凝膠層；相應的轉膜時間過久則會使蛋白印跡模糊，從而影響一抗孵育和二抗結合。鑒于此，本研究經(jīng)預實驗摸索，最終選擇15%分離膠，電泳和轉膜2小時對Aβ1-42和Aβ1-40進行蛋白印跡，考察其表達情況。

目前在對蛋白調(diào)控所采用的技術手段中，Western-blot法主要進行定量，考察相關蛋白具體表達量。而免疫組化法則從定性角度出發(fā)，一方面更直觀的展現(xiàn)蛋白與抗體特異性結合程度，另一方面佐證定量結果。因免疫組化法是通過抗體與組織病理切片上的抗原位點結合來檢測蛋白表達情況，所以組織病理切片的制作顯得尤為重要。切片不易過厚，切片完成后應注意保存，避免組織切面受到外界損傷；處理前應進行充分的脫蠟，時間不宜少于2小時；選擇條件溫和、附帶損傷較小的檸檬酸緩沖液對抗原進行修復，去除過氧化氫酶，充分暴露抗原位點，使一抗與位點完全契合。以上兩種方法作為分子生物學常用檢測手段，相輔相成，為蛋白的調(diào)控研究提供了技術保障。

圖3 各組小鼠海馬CA1區(qū)Aβ1-42染色(免疫組化，×200)Fig.3 The expressions of Aβ1-42 in hippocampus CA1 of mice in different groups(immunohistochemical method,×200)注：A為正常組，B為模型組，C為多奈哌齊組，D為肉蓯蓉苯乙醇總苷高劑量組， E為肉蓯蓉苯乙醇總苷中劑量組，F(xiàn)為肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組，G為毛蕊花糖苷組。Note：A is Control,B is Model,C is donepezil,D is PhGs-H,E is PhGs-M,F is PhGs-L,G is Acteoside.

圖4 各組小鼠Aβ蛋白表達結果Fig.4 Results of Aβ proteins expression in different group of mice注：A為正常組，B為模型組，C為多奈哌齊組，D為肉蓯蓉苯乙醇總苷高劑量組， E為肉蓯蓉苯乙醇總苷中劑量組，F(xiàn)為肉蓯蓉苯乙醇總苷低劑量組，G為毛蕊花糖苷組。Note：A is Control,B is Model,C is donepezil,D is PhGs-H,E is PhGs-M,F is PhGs-L,G is Acteoside.

本研究借助HE等方法對腦內(nèi)海馬病變情況、Aβ相關蛋白表達進行了考察，結果顯示，經(jīng)肉蓯蓉苯乙醇苷干預后，AD模型小鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)均有不同程度的改善，Aβ1-42和Aβ1-40的表達量明顯下調(diào)，此外通過研究還發(fā)現(xiàn)毛蕊花糖苷干預組保護神經(jīng)元作用優(yōu)于苯乙醇總苷組，提示毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉苯乙醇苷代表性單體，相較于肉蓯蓉苯乙醇總苷，其改善AD模型鼠腦區(qū)病理改變進而發(fā)揮拮抗AD作用潛能巨大，具體作用機制有待后續(xù)進一步研究。本研究完善肉蓯蓉從Aβ角度拮抗AD作用機制的研究資料的同時，為后期進一步闡明肉蓯蓉有效組分或活性單體抗AD作用機制奠定研究基礎。