葉穎曉，張朋展，王 麗，劉 淼，劉 毅，麻兵繼*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002；2安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，安慶 246052

白花蛇舌草，別名蛇舌草、龍舌草、鶴舌草等，為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld)的帶根全草，國內(nèi)多個省份廣泛分布(廣東、福建、江西、河南、江蘇、安徽、浙江等)[1]。其性寒，味苦、甘，歸胃、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫止痛的功效。白花蛇舌草臨床應(yīng)用廣泛，主治胃腸炎、闌尾炎、泌尿系感染、扁桃體炎、肺炎等病癥，外用治療毒蛇咬傷、癰腫瘡癤等癥[2]。白花蛇舌草具有較好的抗腫瘤活性，中醫(yī)臨床上多用于腹部腫瘤治療和癌癥放射、化療后的輔助治療，效果明顯[3]。目前白花蛇舌草已制成膠囊、藥片、注射液、茶和飲料等不同藥品制劑與保健品，具有較好的市場開發(fā)前景[4]?，F(xiàn)代研究表明，白花蛇舌草主要化學(xué)成分有多糖、蒽醌類、黃酮類、萜類、甾醇類等[5]。近年來，中藥多糖的研究越來越受到重視，隨著中藥多糖制備、結(jié)構(gòu)、合成、藥理學(xué)及臨床應(yīng)用等方面研究的不斷深入，多糖已成為中藥活性先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和新藥研發(fā)的重要源泉[6]。因此，研究中藥多糖最佳的提取方法和多糖含量測定方法對評價中藥材的內(nèi)在品質(zhì)與后續(xù)深入開發(fā)均有具有重要意義。

研究表明多糖為白花蛇舌草的重要活性成分之一，是有效的免疫調(diào)節(jié)劑，可通過清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化和提高SOD活力發(fā)揮抗衰老作用，對肝癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[7,8]。水提法、酶提法、超聲提取法、微波提取法、多法復(fù)合聯(lián)用等提取多糖的方法在蛇舌草多糖的提取中均有使用。另外，馬河等分離純化了一種白花蛇舌草多糖并只對其單糖組成進(jìn)行了分析[9]。吳厚銘等采用甲基化與GC-MS方法初步表征了一種白花蛇舌草免疫多糖可能的糖鏈結(jié)構(gòu)[10]。總體而言，目前關(guān)于白花蛇舌草多糖的文獻(xiàn)相對集中于藥理活性研究方面，而白花蛇舌草多糖深入的結(jié)構(gòu)解析的研究較少見報道。

近年來，河南省駐馬店確山、汝南等地逐漸發(fā)展為國內(nèi)最大的白花蛇舌草人工栽培區(qū)，該地區(qū)白花蛇舌草年產(chǎn)高達(dá)5 000噸，約占全國總產(chǎn)量的二分之一。目前關(guān)于白花蛇舌草化學(xué)成分研究、藥理活性以及臨床應(yīng)用等方面的研究已有很多報導(dǎo)。研究表明，不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草的化學(xué)成分、微量元素及其含量存在一定的差異[11,12]，鑒于當(dāng)前藥典中沒有規(guī)定白花蛇舌草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且活性成分研究尚不充分，據(jù)現(xiàn)有基礎(chǔ)對全國不同產(chǎn)區(qū)白花蛇舌草進(jìn)行統(tǒng)一的質(zhì)量評價難度較大，且科學(xué)性不夠。為進(jìn)一步研究河南地區(qū)白花蛇舌草的多糖的含量范圍和藥用價值，本文研究了傳統(tǒng)熱水、超聲波輔助、纖維素酶三種不同提取法對白花蛇舌草多糖的提取得率、總碳水化合物含量、雜質(zhì)含量和抗氧化活性的影響。本試驗以苯酚-濃硫酸顯色法、Bradford法與Folin-Ciocalteus法分別測定了白花蛇舌草總碳水化合物含量、總蛋白和總酚類成分含量。同時，本試驗還以羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原力為指標(biāo)，評價了以上三種多糖的抗氧化活性作。本研究結(jié)果以期為河南地區(qū)人工栽培的白花蛇舌草藥材的內(nèi)在質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而為今后全國白花蛇舌草制定統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與資源的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白花蛇舌草藥材采于河南省駐馬店市確山縣白花蛇舌草基地，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系文春南老師鑒定為白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld；纖維素酶(北京索萊寶科技有限公司)，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。YU-1810型號紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；Discovery DV215CD型號精密電子天平(美國奧豪斯公司)；KQ-5200DE型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；JW-1032低速離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)。

1.2 不同方法粗多糖的制備

將干品白花蛇舌草精揀打粉，過100目篩，粉末自封袋密封保存于干燥器中。用烘干法檢測干燥粉末中水分含量。將干燥粉末用5倍無水乙醇浸泡于搖床中振搖24 h?；厥丈锨逡掖家海娓沙恋矸勰?，再測其水分含量，裝于自封袋保存在干燥器中。經(jīng)測定，白花蛇舌草藥材干粉含水量為10.44%，醇溶物含量為9.31%，脫脂溶性成分后的白花蛇舌草干粉含水量為7.20%。

1.2.1 傳統(tǒng)熱水浸提法

精密稱量處理后的白花蛇舌草粉末10.11 g，加20倍體積水加熱攪拌提取80 min，加熱溫度80 ℃。提取完成后抽濾，濾渣再加15倍量水提取1次，提取80 min，合并2次提取液，濃縮至約20 mL，冷卻至室溫，加乙醇至乙醇濃度為90%，4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 rpm離心10 min，沉淀加水復(fù)溶，冷凍干燥，即得。

1.2.2 超聲波輔助提取法

精密稱量處理后白花蛇舌草粉末10.31 g，加20倍量水超聲提取60 min，超聲功率為120 W。提取完成后抽濾，濾渣再加水超聲提取1次，加水量15倍，提取60 min，合并2次提取液，濃縮至約20 mL，冷卻至室溫，加乙醇至乙醇濃度為90%，4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 rpm離心10 min，沉淀加水復(fù)溶，冷凍干燥，即得。

1.2.3 纖維素酶提取法

精密稱量處理后白花蛇舌草粉末10.21 g，加藥材量1.2%的纖維素酶和4倍量水進(jìn)行酶解，酶解溫度55 ℃，酶解pH值為4.8，酶解時間60 min。提取完成后抽濾，濾渣再加酶提取1次，加水量7倍，提取60 min，合并2次提取液，濃縮至約20 mL，冷卻至室溫，加乙醇至乙醇濃度為90%，4 ℃冰箱中靜置過夜，4 000 rpm離心10 min，沉淀加水復(fù)溶，冷凍干燥，即得。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.3.1 苯酚溶液與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取苯酚5 g，用純凈水溶解并定容于100 mL容量瓶中，混合均勻，即得5%苯酚溶液。

稱取105 ℃已干燥至恒重的葡萄糖100.80 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，混合搖勻，即得濃度為1.008 0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

分別精密移取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，分別定容至10 mL，得不同濃度的稀釋液。精密吸取上述稀釋液1 mL，再加1 mL 5%苯酚溶液，濃硫酸5 mL于20 mL具塞干燥玻璃試管中，沸水浴加熱15 min，迅速冷卻至室溫。按照紫外-可見分光光度法，在490 nm處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 供試品溶液制備

精密稱量由傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶提取法所得的干燥粗多糖樣品各50 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，混合搖勻，即得供試品溶液。

1.4.2 精密度試驗

精密量取1.4.1項下的三種樣品溶液，按照1.3.2項下檢測方法進(jìn)行平行測定6次，計算總碳水化合物含量，計算RSD值。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗

精密量取1.4.1項下的三種樣品溶液，按照1.3.2項下檢測方法分別于0、2、4、6、8、10、12 h對每份樣品重復(fù)測定吸光度，計算RSD值。

1.4.4 重復(fù)性試驗

按照1.2與1.4.1項下的方法制備三種粗多糖的供試品溶液各6份，按照1.3.2項下檢測方法平行測定3次，計算總碳水化合物含量，計算RSD值。

1.4.5 加樣回收率試驗

按照1.4.1項下的方法制備三種粗多糖的供試品溶液，高低兩種濃度且各2份，每份加入定量固定濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3.2項下檢測方法平行測定3次，計算平均加樣回收率以及RSD值。

1.5 三種粗多糖總糖含量檢測

精密量取1.4.1項下的三種樣品溶液，按照1.3.2項下檢測方法。由回歸方程計算碳水化合物的含量。

1.6 三種粗多糖雜質(zhì)分析

1.6.1 三種粗多糖總蛋白與總酚含量檢測

按Folin-Ciocalteus法測定總酚含量，稱取三種粗多糖樣品粉末各750 mg，用40 mL 70%乙醇于100 mL錐形瓶中，常溫超聲40 min，4 000 rpm離心10 min，上清液倒入100 mL容量瓶中，殘渣再用70%乙醇溶液30 mL重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用70%乙醇溶液定容至100 mL，搖勻即得測試溶液。以蒸餾水為陰性對照，用移液槍分別移取濃度均為2.25 mg/mL的三種樣品溶液各1 mL于潔凈試管中，后依次加蒸餾水5 mL、福林酚試劑1 mL、7.5% Na2CO3溶液3.5 mL，渦旋振蕩器上搖勻。室溫靜置2小時后，用紫外分光光度儀于765 nm波長下測定溶液的吸光度。以濃度分別為0、10、20、40、60、80、100 μg/mL的焦性沒食子酸溶液同法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按Bradford法測蛋白質(zhì)濃度，蒸餾水為陰性對照，用移液槍分別精密移取三種提取方法項下的樣品溶液各50 μL，滴加到96孔板中，再分別加入200 μL的考馬斯亮藍(lán)(CBB)。靜置10 min后，用酶標(biāo)儀測于595 nm波長下檢測樣品溶液吸光度，平行測定3次。以濃度分別為0、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液同法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 三種方法的粗多糖透光度檢測

量取1.4.1方法項下樣品測試溶液各3.5 mL，于石英比色皿中，用紫外分光光度儀在200～1 100 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以368 nm波長處的最高吸收峰作為檢測透光度的波長。

配制濃度梯度分別為0、0.1、0.25、0.4、0.5、0.6、0.75、0.9、1 mg/mL的三種樣品溶液，各量取200 μL，滴加到96孔板中，用酶標(biāo)儀測于368 nm波長下測定樣品溶液的吸光度，以吸光度與濃度繪圖。

1.7 抗氧化性檢測

1.7.1 清除羥基自由基能力測定

根據(jù)劉迪等[13-15]的方法，稍作修改，測定樣品對羥基自由基的清除率。三種粗多糖溶液的濃度均為0.1、0.25、0.4、0.5、0.6、0.75、0.9、1、1.5、3.0 mg/mL，以同濃度的VC為對照品。反應(yīng)體系中依次加入4.5×10-3mol/L FeSO4溶液1 mL，4.5×10-3mol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，及1 mL不同濃度的多糖樣品液與對照品溶液，最后加6×10-3mol/L H2O22 mL，啟動反應(yīng)，37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，在510 nm下測定各濃度樣品的吸光度?？瞻捉M以相同體積蒸餾水代替樣品溶液。羥基自由基清除率計算公式如。

羥基自由基清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]/AO×100%

其中，A0為樣品溶液的吸光度，AX為抗氧化劑本底吸光度，AX0為空白對照吸光度。

1.7.2 清除DPPH自由基能力測定

根據(jù)屈義等[13,16,17]的方法，稍作修改，測定樣品對DPPH自由基的清除率。三種粗多糖溶液的濃度均為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、3、4.5、6、7.5 mg/mL，以同濃度的VC為對照品。取不同濃度的多糖待測液與對照品溶液各2 mL，加入0.5×10-4mol/L的DPPH溶液2 mL，搖勻，室溫避光靜置30 min，以蒸餾水代替樣品液為空白，測定其在517 nm處的吸光度。計算公式與1.7.1相同。

1.7.3 還原能力測定

根據(jù)任嘉興等[18-20]的方法，稍作修改，測定還原能力。三種粗多糖溶液的濃度均為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、3、4.5、6、7.5 mg/mL，以同濃度的VC為對照品。精密量取1 mL不同濃度的三種粗多糖樣品溶液與對照品溶液至試管中，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH=7.4)，2.5 mL鐵氰化鉀溶液(1.0%)，混合均勻后置于50 ℃恒溫水浴中保溫20 min，取出，迅速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，混合均勻，于4 000 rpm離心10 min，吸取上清液2.5 mL于另一試管中，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵溶液(0.1%)，混勻后靜置10 min，于700 nm處測定吸光度值，吸光度值越大，表明其還原能力越強。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法粗多糖的得率

圖1 不同提取方法所得粗多糖圖片F(xiàn)ig.1 Crude polysaccharides obtained by different extraction methods注：A為傳統(tǒng)熱水提取法粗多糖，B為超聲輔助提取法，C為纖維素酶提取法。Note:A Hot water extraction,B Ultrasonic extraction,C Cellulase extraction.

三種提取方法所的粗多糖的圖片如圖1 A～C。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法的粗多糖的外觀顏色(呈棕灰至灰褐色)明顯比纖維素酶提取法的粗多糖的外觀顏色深(呈灰白色)，推測可能是由于傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法相較纖維素酶提取法所得的粗多糖含有的雜質(zhì)種類較多或雜質(zhì)含量較高，導(dǎo)致顏色加深。

三種提取方法所得粗多糖的得率見表1。結(jié)果顯示豫產(chǎn)白花蛇舌草藥材干粉經(jīng)傳統(tǒng)熱水提取法、超聲輔助提取法、纖維素酶提取法的粗多糖得率分別為6.77%、6.37%、4.81%，原藥材的粗多糖含量分別為67.72、63.71、48.08 mg/g，三種提取方法粗多糖得率均具有顯著性差異。

表1 不同提取方法粗多糖得率Table 1 Extraction yields of crude polysaccharide obtained by different extraction methods(n =

注：與傳統(tǒng)熱水提取法組對照比較，*P< 0.05，**P< 0.01。粗多糖縮寫為CP(下同)。

Note:Compare with hot water extraction,*P< 0.05,**P< 0.01.Crude polysaccharide is abbreviated as CP (similarly hereinafter).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

本實驗中葡萄糖、沒食子酸、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見表2，R2值顯示在試驗濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與對應(yīng)吸光度值均有良好的線性關(guān)系。

表2 葡萄糖、沒食子酸、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Table 2 Calibration equation of glucose,pyrogallic acid,bovine serum protein

注：y為吸光度；x為標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度 (mg/mL)。

Note:y,absorbance;x,concentration of compound (mg/mL).

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察

傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶提取法所得粗多糖的總碳水化合物含量的平均值分別是155.78、115.27、136.27 mg/mL；RSD分別為0.08%、0.23%、1.15%。結(jié)果表明苯酚-濃硫酸顯色法測定三種粗多糖總碳水化合物含量的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性考察

傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶提取法的粗多糖溶液在12 h內(nèi)吸光度的平均值分別是1.47、1.21、1.47；RSD分別為1.19%、1.56%、1.22%。表明苯酚-濃硫酸顯色法測定三種粗多糖總碳水化合物含量的試樣溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性考察

傳統(tǒng)熱水提取法、超聲波輔助提取法、纖維素酶提取法所得粗多糖的總碳水化合物含量分別為150.82、121.68、142.92 mg/mL；RSD分別為1.43%、2.77%、1.78%。表明苯酚-濃硫酸顯色法測定三種粗多糖總碳水化合物含量的重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率考察

高低兩種濃度的三種粗多糖樣品的平均碳水化合物含量、加標(biāo)樣量以及平均加樣回收率結(jié)果見表3。

2.4 三種粗多糖中總碳水化合物含量檢測

三種提取法所得粗多糖中總碳水化合物含量結(jié)果見表4。粗多糖濃度一致的條件下檢測多糖含量，三種粗多糖樣品中總碳水化合物含量均表現(xiàn)出顯著性差異，分別為298.14 mg/g(傳統(tǒng)熱水提取法)>278.92 mg/g(纖維素酶提取法)>246.83 mg/g(超聲波輔助提取法)，這可能是由于傳統(tǒng)熱水提取法的溫度較高(80 ℃)，且白花蛇舌草中水溶性多糖的比例較高，高溫促進(jìn)了水溶性多糖的溶出。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n =3)Table 3 Results of standard addition recovery rate(n =3)

注：表中原樣總碳水化合物含量與測得總量均為三次平行試驗的平均值。

Note:In the
Table,Sample contents and measured total contents are the average values of three parallel tests.

表3 不同提取方法粗多糖總碳水化合物含量Table 3 Total carbohydrate contents of crude polysaccharide obtained by different extraction methods(n

注：與傳統(tǒng)熱水提取法組對照比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note:Compare with hot water extraction,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.5 三種粗多糖雜質(zhì)分析

2.5.1 三種粗多糖總蛋白與總酚類成分含量檢測

三種粗多糖總蛋白與總酚含量檢測結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法提取的粗多糖中總酚含量分別為5.9、5.31 mg/g，兩種方法得到的總酚含量無顯著性差異，但較纖維素酶提取法(總酚含量為2.82 mg/g)具有極顯著性差異，表明纖維素酶提取法提取的粗多糖中的總酚含量顯著低于傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法。另外，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法提取的粗多糖中總蛋白含量分別為28.59、23.26 mg/g，兩種方法的總蛋白含量無顯著性差異，但與纖維素酶提取法(總蛋白含量為4.96 mg/g)具有極顯著性差異，此結(jié)果表明纖維素酶提取法提取的粗多糖中的總蛋白含量顯著低于前兩者，這可能是由于纖維素酶提取法的溶液呈酸性(pH≈5.5)，部分蛋白發(fā)生水解，也可能是纖維素酶提取法的條件溫和，溫度較低，不利于部分水溶性蛋白質(zhì)溶出。

表5 不同提取方法所得粗多糖總酚類成分含量Table 5 Total phenolic and protein contents of crude polysaccharide obtained by different extraction methods(n

注：與傳統(tǒng)熱水提取法組對照比較，**P< 0.01。

Note:Compare with hot water extraction,**P< 0.01.

2.5.2 三種粗多糖透光度檢測

結(jié)果如圖2，在濃度梯度范圍內(nèi)，相同濃度條件下傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法提取的粗多糖的吸光度明顯高于纖維素酶提取法提取的粗多糖的吸光度。由吸光度與透光率的關(guān)系(A=-lgT)，吸光度越大，透光率越低，可推測出傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法提取的粗多糖中的色素含量更高，或者色素顏色更深。由2.5.1中粗多糖樣品總酚含量檢測結(jié)果顯示，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲輔助提取法所得粗多糖中的酚類成分含量比纖維素酶提取法所得粗多糖中的酚類成分含量高了近1倍，而酚羥基易氧化成有色醌類物質(zhì)，使樣品變?yōu)辄S色、紅棕色甚至棕褐色。研究證明自然放置30天即變成棕褐色、其含量降為標(biāo)示量的83%[21]。

圖2 不同提取方法所得粗多糖的透光度Fig.2 Transmittance of crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6 抗氧化性檢測

2.6.1 清除羥基自由基能力測定

三種粗多糖羥基自由基能力測定結(jié)果如圖3。在實驗濃度范圍內(nèi)三種粗多糖對·OH的清除作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強，表明豫產(chǎn)白花蛇舌草多糖具有很高的羥基自由基清除潛力。濃度在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)三種粗多糖的清除作用顯然均略高于VC，且對·OH的清除率作用隨濃度的增加顯著升高，如在1.0 mg/mL時，清除羥基自由基能力分別達(dá)到了77.86%、76.35%、64.57%。但樣品濃度超過1.5 mg/mL時，隨濃度的增加，清除率緩慢增加，趨于水平。另外，樣品濃度在1 mg/mL以下時，超聲波輔助提取法所得粗多糖的清除羥基自由基能力高于同濃度的傳統(tǒng)熱水提取法和纖維素酶提取法所得粗多糖。但濃度在1.0～3.0 mg/mL時，傳統(tǒng)熱水提取法所得粗多糖的清除羥基自由基能力高于同濃度的超聲波輔助提取法和纖維素酶提取法所得粗多糖。

圖3 不同提取方法所得粗多糖的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging capacity of crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6.2 清除DPPH自由基能力測定

三種粗多糖羥基自由基能力測定結(jié)果如圖4。在實驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)三種粗多糖對DPPH自由基的清除作用隨質(zhì)量濃度的增大而增強，但它們的清除作用均低于VC。濃度在0.1～1.0 mg/mL時，三種粗多糖對DPPH自由基的清除作用隨濃度的增加顯著增強。濃度在0.75 mg/mL時，傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波輔助提取法所得粗多糖對DPPH自由基的清除率均已達(dá)77.2%。纖維素酶提取法所得粗多糖對DPPH自由基的清除率在濃度為3 mg/mL時達(dá)到83.16%，并在84%左右趨于水平。在實驗濃度范圍內(nèi)，濃度小于2.0 mg/mL時，傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波輔助提取法所得粗多糖的清除DPPH自由基能力高于同濃度的纖維素酶提取法所得粗多糖。但濃度大于2.0 mg/mL時，酶提法粗多糖較另外兩種方法DPPH自由基清除率更高?？傊ギa(chǎn)白花蛇舌草多糖亦有良好的DPPH自由基清除活力。

圖4 不同提取方法所得粗多糖的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging capacity of crude polysaccharides obtained by different extraction methods

2.6.3 還原能力測定

三種粗多糖溶液的還原能力測定結(jié)果如圖5。三種粗多糖溶液的還原能力均隨濃度的增大而增大，且在試驗濃度范圍內(nèi)并沒有達(dá)到峰值有繼續(xù)增加的趨勢。隨著濃度的增高，傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波輔助提取法二者與酶提法相比，其粗多糖還原力增加的趨勢更加明顯，而傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波輔助提取法相比，粗多糖還原力在各濃度幾乎保持一致。

圖5 不同提取方法所得粗多糖的還原力Fig.5 Reducing ability of crude polysaccharides obtained by different extraction methods

3 結(jié)論

本論文研究了不同提取方法對河南地區(qū)白花蛇舌草粗多糖的得率、總碳水化合物含量和抗氧化活性的影響。研究結(jié)果表明，三種粗多糖的提取率有明顯差異，分別為傳統(tǒng)熱水提取法得率最高，超聲波輔助提取法次之，纖維素酶提取法得率最低；三種粗多糖中總碳水化合物含量表現(xiàn)出顯著性差異，分別為傳統(tǒng)熱水提取法含量最高，纖維素酶提取法次之，超聲波輔助提取法含量最低。另外，三種粗多糖的總蛋白與酚類成分含量在傳統(tǒng)熱水提取法與超聲波輔助提取法之間未表現(xiàn)出明顯差異，但二者與纖維素酶提取法之間表現(xiàn)出顯著性差異。在相同濃度下，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲波輔助提取法所得粗多糖溶液的透光度均低于纖維素酶提取法所得粗多糖溶液。抗氧化性實驗結(jié)果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)，傳統(tǒng)熱水提取法與超聲波輔助提取法的粗多糖溶液的還原力與羥基自由基清除能力均優(yōu)于相同濃度的酶提法的粗多糖溶液。值得注意的是，當(dāng)濃度大于2.0 mg/mL時，酶提法所得粗多糖溶液較傳統(tǒng)熱水提取法和超聲波輔助提取法所得粗多糖溶液的DPPH自由基清除率更高，但濃度小于2.0 mg/mL時，則另外兩種多糖清除DPPH自由基能力高于同濃度的酶提法所得粗多糖。傳統(tǒng)熱水提法是一種最常用的多糖提取方法，相比其他方法，其操作較簡便、經(jīng)濟成本低。在本次研究所采用的三種白花蛇舌草多糖提取方法中，傳統(tǒng)熱水法提取的粗多糖較另外兩種方法所得粗多糖在提取率和總碳水化合物含量方面均為最高，亦具有較好的抗氧化潛力，展現(xiàn)出了一定的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢。