劉毅東 吳 旻 葉惟靖 黃翼然

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（上海 200127）

尿道下裂發(fā)病率約1/300，并且呈逐年增長的趨勢(shì)[1-3]，目前眾多國內(nèi)外對(duì)于尿道下裂的發(fā)病原因進(jìn)行了深入的研究，但是均未得出一個(gè)明確結(jié)論。目前熱門的流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室調(diào)查將尿道下裂發(fā)病病因指向表觀遺傳學(xué)方向[4]，其中由于胚胎在8～14周尿道形成的關(guān)鍵時(shí)期[5,6]，可能會(huì)受到內(nèi)源性或者外源性因素的影響，通過改變雄激素基因表達(dá)表觀遺傳編程作用途徑，影響胎兒雄激素對(duì)胎兒的作用，從而影響了正常陰莖及尿道的發(fā)育過程。這引起我們對(duì)尿道下裂患者發(fā)病原因進(jìn)行探究。查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)部分相關(guān)基因甲基化在尿道下裂患者組織中高表達(dá)，并提出基因甲基化可能是尿道下裂的發(fā)病機(jī)制。我們對(duì)于我們?nèi)巳褐心虻老铝雅c甲基化關(guān)系的研究甚少，為了驗(yàn)證這條途徑是否對(duì)尿道下裂患者發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生影響，我們對(duì)123例患者包皮內(nèi)板組織進(jìn)行雄激素相關(guān)基因甲基化定量檢測(cè)，為尿道下裂后續(xù)基因治療提供部分基礎(chǔ)。

資料和方法

一、臨床資料

收集自2012年到2015年于我院接受手術(shù)的患者123名，其中包括實(shí)驗(yàn)組尿道下裂修補(bǔ)術(shù)患者包皮內(nèi)板96 例，年齡從 3.5～8 歲。 平均年齡（5.0±1.5）歲，又根據(jù)患者術(shù)前尿道開口的位置，將尿道下裂患者分為輕中度和重度組。輕中度組定義為尿道開口于冠狀溝及陰莖體中段；重度組定義為尿道口開口于陰莖體近端及會(huì)陰部。其中輕中度組患者55例，重度組患者41例，對(duì)照組為在我院行包皮環(huán)切的患者包皮內(nèi)板27例，年齡從 3.7～7.5 歲，平均（5.0±0.8）歲，術(shù)前均確定有正常的尿道開口，陰莖及尿道發(fā)育正常。所有患者均排除其他生殖器疾病、隱睪、染色體異常及內(nèi)分泌功能缺陷，術(shù)前基因檢查排除AR基因及SRD5A2基因突變情況，術(shù)前均未接受激素治療。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）對(duì)組織提取樣本的要求

1.樣品類型：基因組DNA，溶解在H2O或TE（pH 8.0）中。樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0之間，無明顯降解與蛋白污染。提取的DNA樣本濃度：最低濃度不低于20ng/μL。

2.樣品總量：每個(gè)樣品總量1μg，滿足200個(gè)目的片段測(cè)序。

（二）試劑耗材

TruSeq DNA樣品制備試劉盒；EpiTect亞硫酸氫鹽試劉盒；TruSeq PE簇生成試劑盒；TruSeq測(cè)序試劑盒；QIAquick PCR純化試劉盒；QIAquick凝膠提取試劑盒；NEBNext脫氧核糖核酸片段化酶。

（三）實(shí)驗(yàn)儀器

AB 2720熱循環(huán)儀；Xiang Yi H1650-W離心機(jī)；渦旋儀；凝膠電泳；NanoDrop定量儀；Ambion磁性支架；Invitrogen Obit分光光度計(jì)；Illumina cbot簇生成支架；Illumina基因組分析儀IIX。

（四）引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)患者AR基因及SRD5A2基因設(shè)計(jì)的引物見表 1、表 2

表1 AR基因設(shè)計(jì)引物

表2 SRD5A2基因設(shè)計(jì)引物

（五）實(shí)驗(yàn)步驟

1.亞硫酸氫鹽處理：使用EpiTect Bisulfite Kit進(jìn)行樣本處理。

2.樣本目標(biāo)片段多重PCR反應(yīng)：使用以下PCR條件：A 20μL混合溶液其中包括：1×反應(yīng)緩沖液（TAKARA）,2mmoL Mg2+,0.2mmoL dNTP,0.1μMoL引物，1 U HotStarTaq聚合酶 (TAKARA)and 2μL模板DNA。PCR循環(huán)條件：預(yù)熱階段：95℃，2min；循環(huán)階段：94℃，20 s，11 個(gè)循環(huán)；63℃每個(gè)循環(huán) 40 s；72℃ 1min；94℃，20 s，24 個(gè)循環(huán)；65℃，30 s； 72℃， 1 mins。 延伸階段：72℃，2 min。

3.相同樣本的多重PCR反應(yīng)體系混合。

4.樣本添加特異性標(biāo)簽序列：使用以下PCR條件：20μL 混合溶液，包括 1×反應(yīng)緩沖液（NEB Q5TM），0.3 mmoL dNTP，0.25μmoL 引物，0.25μmoL 索引引物，1 U Q5TM DNA聚合酶（NEB）和1μL稀釋模板，循環(huán)再98℃，30s；11 個(gè)循環(huán) 98℃， 10 s；65℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min。

5.定量后應(yīng)用高通量Illumina Genome Analyzer IIx上機(jī)測(cè)序。

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組96例，對(duì)照組27例的AR基因及SRD5A2基因甲基化個(gè)體水平的結(jié)果見表3。AR基因CpG島共測(cè)得46個(gè)甲基化位點(diǎn)，整體水平下AR基因甲基化在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,均值0.112±0.051 vs 0.107±0.019，P＞0.05（圖 1）。 SRD5A2 基因 CpG島共測(cè)得25個(gè)甲基化位點(diǎn)，整體水平下SRD5A2基因甲基化在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均值0.044±0.008 vs 0.039±0.006，P＜0.05（圖 2，圖 3）。

圖1 AR基因CpG島在46個(gè)不同的rs片段中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性研究（96 vs 27，46個(gè)位點(diǎn)，總體P＞0.05）

圖2 SRD5A2基因CpG島在25個(gè)不同的rs片段中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異性研究（96vs27，25個(gè)位點(diǎn)，總體P＜0.05）

表3 AR基因及SRD5A2基因甲基化個(gè)體水平研究（x±s）

圖3 AR基因及SRD5A2基因甲基化亞組水平研究

討 論

胚胎在8～14周尿道形成的關(guān)鍵時(shí)期[5,6]，患者受到內(nèi)源性或者外源性因素的影響，改變雄激素基因表達(dá)表觀遺傳編程作用途徑，影響了正常陰莖及尿道的發(fā)育過程。雄激素作用相關(guān)過程：睪酮（T）在SRD5A2的作用下生成雙氫睪酮（DHT），DHT作用于AR，影響男性生殖器的發(fā)育過程[7]。其中任意一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，將會(huì)影響到男性生殖器的正常發(fā)育，最終可能成為尿道下裂發(fā)病的重要原因之一。Wang等曾報(bào)道SRD5A2基因突變?cè)谥袊巳耗虻老铝训囊粋€(gè)重要的發(fā)病因素，AR基因突變并沒有在尿道下裂中出現(xiàn)[8]。Akcay等人也同樣報(bào)道了在雄激素不敏感的患者中出現(xiàn)SRD5A2基因突變，未發(fā)現(xiàn)AR基因突變現(xiàn)象[9]?？v觀國內(nèi)外對(duì)于這一方面的研究，表觀遺傳學(xué)的研究是近來一大熱門[10,11]，尤其是腫瘤領(lǐng)域[12-14]。但是我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于尿道下裂疾病發(fā)生與雄激素相關(guān)基因甲基化的研究少有報(bào)道。Vottero等[15]在高加索人人群20例尿道下裂患兒的包皮組織中找到了表觀遺傳學(xué)異常的證據(jù)。其研究結(jié)果表明尿道下裂實(shí)驗(yàn)組的包皮組織AR基因甲基化的程度明顯高于正常對(duì)照組的包皮組織。以上研究提示，雄激素作用相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)改變，影響基因的表達(dá)過程。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，高通量的DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)隨之出現(xiàn)，Choudhry等第一次使用高通量甲基化分析檢測(cè)了12名尿道下裂患者與8名對(duì)照組CpG位點(diǎn)甲基化差異性[16]，這一作用機(jī)制在我們的尿道下裂患者中是否也是如此或者影響到什么程度，引起我們的興趣。

AR基因及SRD5A2基因正常表達(dá)在雄激素作用途徑中起著至關(guān)重要的作用，任何一方表達(dá)受到抑制，均會(huì)影響其正常的發(fā)揮作用[17]。這給我們啟示是：對(duì)于非基因突變的尿道下裂患者是否存在甲基化情況。于是針對(duì)AR基因及SRD5A2基因附近區(qū)域CpG島甲基化定量檢測(cè)進(jìn)入我們的課題。

我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)AR基因及SRD5A2基因附近區(qū)域CpG島進(jìn)行深度、高準(zhǔn)確度檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：基因水平下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間AR基因甲基化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。部分RS位點(diǎn)盡管存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，但是其甲基化率過低，所以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在AR基因CpG島甲基化程度并不考慮其差異性；同樣，SRD5A2基因甲基化在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間數(shù)據(jù)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但是考慮其甲基化均值太低，亦不考慮其甲基化的差異性。兩者在輕中度組、重度組同樣甲基化程度呈現(xiàn)極低狀態(tài)，亦不考慮其甲基化存在區(qū)別。這說明在我們的患者當(dāng)中尿道下裂疾病發(fā)生發(fā)展及其嚴(yán)重程度可能與雄激素作用相關(guān)基因AR基因、SRD5A2基因CpG島甲基化程度關(guān)聯(lián)性較小。這與Vottero[15]等報(bào)道的高加索人人群AR基因甲基化結(jié)果存在差異。該結(jié)果表明在我們?nèi)巳褐锌赡艽嬖谀虻老铝鸦颊叩陌l(fā)病機(jī)理不同于高加索人人群。中國幅員遼闊，環(huán)境習(xí)性差異大，或許還需要多中心大樣本合作檢驗(yàn)。本文不足之處是未解釋尿道下裂的發(fā)病機(jī)制，今后需要在蛋白水平上進(jìn)一步研究。

結(jié) 論

在我們的患者中雄激素相關(guān)基因AR及SRD5A2基因CpG島甲基化抑制了雄激素發(fā)揮作用這條途徑，可能并不是尿道下裂發(fā)病的主要機(jī)制。