張海濤 劉德風(fēng) 毛加明 張 哲 楊宇卓 ，4 張洪亮 ，4趙連明 林浩成 洪 鍇 姜 輝 ，4* 唐文豪 ，4*

1.北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院男科；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心；4.北京大學(xué)第三醫(yī)院人類精子庫

復(fù)發(fā)性流產(chǎn) (recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，孕12周之前多見，又稱為早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1,2]，是妊娠期最常見的妊娠并發(fā)癥，其發(fā)生率為0.8%～1.4%[3]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因比較復(fù)雜，臨床上即使進(jìn)行了詳細(xì)的病因篩查，目前也只有大約50%的病例能查明原因[4]，這些已知因素主要包括遺傳、解剖學(xué)、高齡、內(nèi)分泌、免疫、血栓形成、代謝及感染因素等[4-9]。

目前，針對RSA的病因研究主要集中在女性，男性因素研究較少。研究表明與RSA有明確相關(guān)的男性因素主要是染色體異常和精子DNA損傷，后者臨床上可以通過檢測精子DNA碎片指數(shù)（DFI）進(jìn)行評估。眾所周知，胚胎的遺傳物質(zhì)來自精子和卵母細(xì)胞，胚胎染色體異?；蚧虍惓Ｊ菍?dǎo)致RSA的主要原因[10,11]。此外，有些學(xué)者[12-14]認(rèn)為精子DNA損傷也可能影響胚胎發(fā)育并導(dǎo)致流產(chǎn)，但關(guān)于精子DNA損傷的機(jī)制尚無統(tǒng)一的定論。研究表明精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與精子DNA損傷密切相關(guān)，可能是其損傷的機(jī)制之一[15,16]，目前已成為胚胎早期流產(chǎn)原因研究的熱點(diǎn)。本研究通過檢測我院生殖中心64例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者配偶的精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換，分析其與精液參數(shù)、年齡、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對象

本研究選取2017年1月至2017年10月就診于我院生殖醫(yī)學(xué)中心門診，診斷為RSA的夫婦64對，男性年齡24～52歲。排除以下雙方流產(chǎn)因素：染色體核型(男性或女性)異常、子宮和輸卵管異常、抗磷脂綜合征、多囊卵巢綜合征、胰島素抵抗、甲狀腺功能異常、抗米勒管激素異常等。這項(xiàng)研究由我院生殖中心倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

二、精液分析

禁欲2-7d手淫收集精液，完全液化后，通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng) (computer-aided sperm analysis,CASA)按照 《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》（第五版）[17]規(guī)定進(jìn)行精液常規(guī)分析，其中精子形態(tài)檢測使用Diff-Quik方法，每張玻片至少分析200條精子，并記錄形態(tài)異常的精子所占百分率。剩余精液用于精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與DFI檢測。

三、精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換

使用精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換檢測試劑盒 （苯胺藍(lán)染色法）（華康公司，深圳，中國）測定精子細(xì)胞核中組蛋白與魚精蛋白的比值。首先把5μL制備的精液涂在載玻片上并使其干燥，再將涂片在0.2mol磷酸鹽緩沖液（pH7.2）中的3%緩沖戊二醛中固定30min；然后用5%苯胺藍(lán)水溶液與4%乙酸（pH3.5）混合5min染色，陽性染色表明組蛋白與魚精蛋白轉(zhuǎn)變異常；最后在顯微鏡下評估至少400個(gè)精子細(xì)胞，并計(jì)算頭部染色精子的百分比。精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率≤30%判定為正常。

四、精子DFI檢測

使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精子DFI的檢測，至少計(jì)數(shù)5000個(gè)以上精子且重復(fù)計(jì)數(shù)2次。利用熒光絡(luò)黃染料（吖啶橙）具有高度的核酸特異性染色的特性對精子DNA進(jìn)行染色，染色后斷裂的單鏈DNA精子在激光下呈紅色熒光，而正常雙鏈DNA精子呈綠色熒光。然后采用流式細(xì)胞術(shù)收集熒光信號，再采用專用的軟件分析檢測結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以X±SD表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的比較

納入的64例男性患者中，精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換正常組54例，異常組10例。核蛋白組型轉(zhuǎn)換正常組與異常組比較，精子濃度、正常形態(tài)百分率與DFI有顯著性差異，而年齡、精液量、前向運(yùn)動精子百分比和流產(chǎn)次數(shù)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

二、精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關(guān)性分析

表1 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的比較(x±s)

表2 精子核蛋白轉(zhuǎn)換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關(guān)性分析（n=64）

圖1 精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換與DFI的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

Pearson相關(guān)性分析顯示，精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率與精子DFI顯著正相關(guān)（圖1，表2），與年齡、精液量、精子濃度、前向運(yùn)動精子百分比、正常形態(tài)百分率及流產(chǎn)次數(shù)無明顯相關(guān)性（表2）。

討 論

目前RSA病因不明，而且臨床上缺乏基于循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的診斷和治療策略，所以復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是生殖醫(yī)學(xué)中常見難題之一。流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素中，女方因素研究較多，而男性相關(guān)因素的研究較少，目前僅限于染色體核型分析和精子DNA損傷檢測。精子是一個(gè)非常復(fù)雜和特殊的細(xì)胞，在精子發(fā)生過程中，不僅染色體數(shù)目和DNA含量發(fā)生了變化，核蛋白組型也會發(fā)生規(guī)律性的轉(zhuǎn)換，即由富含賴氨酸的組蛋白逐漸轉(zhuǎn)換為富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白，由于魚精蛋白的體積僅是組蛋白的一半，所以可使精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步濃縮，從而使精子遺傳物質(zhì)抗酸性和穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng)。在人精子中，組蛋白與魚精蛋白的正常轉(zhuǎn)換率約為85%，剩余15%的精子染色質(zhì)仍與特定區(qū)域的組蛋白結(jié)合。如果精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常，則會導(dǎo)致染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散，螺旋化程度降低，從而容易受到活性氧和其他有害因素的影響，精子遺傳物質(zhì)受到損傷，最終影響精子的受精能力，如果損傷程度超出早期胚胎的修復(fù)能力就會影響胚胎早期發(fā)育甚至導(dǎo)致流產(chǎn)[15,16,18-21]。另一方面，魚精蛋白還能抑制DNA轉(zhuǎn)錄及基因表達(dá)，使精子遺傳物質(zhì)保持穩(wěn)定[13]。因此精子內(nèi)核蛋白組型轉(zhuǎn)換是評價(jià)精子成熟度的重要指標(biāo)，與精子DNA損傷關(guān)系密

切[21]。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，人類精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常與精子發(fā)生障礙及DNA損傷密切相關(guān)，同時(shí)可能影響精卵結(jié)合，精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率是目前預(yù)測受精率最有意義的評價(jià)指標(biāo)[22,23]。我們研究結(jié)果表明RSA患者中，精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常組精子濃度、正常形態(tài)百分率明顯低于正常組，DFI則明顯高于正常組。葉飛等[24]研究認(rèn)為核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率≤30%組精子正常形態(tài)百分率明顯高于異常率≥60%組，而DNA損傷則顯著低于后者，但與30%＜異常率＜60%組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其研究結(jié)果與我們的結(jié)果不完全一致，原因可能是前者研究分成核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率≤30%組、30%～60%組和≥30%三組，而我們的研究只分為兩組。同時(shí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示反復(fù)流產(chǎn)夫婦男性精子核蛋白轉(zhuǎn)換異常率與精子DFI顯著正相關(guān)。國內(nèi)外多項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)精子組蛋白轉(zhuǎn)換異?；蛘唪~精蛋白缺乏的患者精子DFI明顯升高[14,24-29]，與我們的研究結(jié)果基本一致。多數(shù)研究使用了不同的技術(shù)進(jìn)行精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換的檢測，例如變性條件下的苯胺藍(lán)、甲苯胺藍(lán)、色霉素A3和吖啶橙等方法進(jìn)行研究，無論使用何種技術(shù)，都得出了相同的結(jié)果。因此，核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常可能是精子DNA損傷的原因之一，可進(jìn)一步影響精子的受精能力及早期胚胎質(zhì)量甚至導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)RSA患者配偶精子中核蛋白組型轉(zhuǎn)換正常組和異常組在精子濃度、正常形態(tài)百分率以及DFI存在顯著差異，同時(shí)核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常率與精子DFI顯著正相關(guān)，其異?？赡苁蔷覦NA損傷的原因之一，可作為臨床評估RSA男性因素的一項(xiàng)可靠指標(biāo)。但本研究入組患者例數(shù)較少，尚需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行深入研究。