朱海俠 王玉玲 潘海城 曾亮明 傅星源 潘小慧李梟辰 俞建萍 范 凱 黃澤敏 翁燕梅 饒云萍

（福州大北農生物技術有限公司 福州 350014）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種急性、高度接觸性消化道疾病。主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，腹瀉仔豬死亡率高達100%[1]。PEDV是一種腸嗜性病毒，主要經消化道進入小腸感染機體。一旦被PEDV感染，PEDV在感染機體的腸絨毛上皮細胞內大量增殖，被感染的細胞迅速溶解壞死，導致明顯的小腸絨毛萎縮，吸收表面積減少，小腸黏膜堿性磷酸酶含量顯著減少，進而引起營養(yǎng)物質吸收障礙，導致腹瀉、脫水、死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)PEDV的感染與仔豬日齡緊密相關，低日齡仔豬的感染和發(fā)病情況更為嚴重，14日齡以下仔豬感染PEDV后，其死亡率為90%，而14～28日齡仔豬的死亡率會下降至40%，提高低日齡仔豬對PEDV的抵抗力是保護仔豬的關鍵[3-4]。疫苗免疫母豬后，誘導乳汁免疫，隨后通過其初乳和乳汁傳遞至新生仔豬，以實現(xiàn)對新生仔豬的早期被動免疫。低日齡仔豬腸道細胞再生較慢，或者初生仔豬各免疫系統(tǒng)還不夠完善可能是導致哺乳仔豬發(fā)病率更為嚴重的原因[5]。而具備相對完善免疫系統(tǒng)的成年豬和育肥豬，病毒感染增殖的同時，腸內的多種免疫細胞針對各自特定靶細胞受體作出應激反應，阻止了豬流行性腹瀉病毒繼續(xù)感染機體。腸道組織中的局部黏膜免疫系統(tǒng)在對抗PEDV感染的過程中發(fā)揮了重要作用[6-7]。

盡管IgG抗體占初乳免疫球蛋白總量的60%以上，但IgA抗體對于中和腸道感染的病原體比IgG抗體更有效果[8]。母源抗體中的IgG免疫球蛋白被仔豬腸道吸收進入血液循環(huán)提供體液免疫，而IgA免疫球蛋白則粘附在腸道上。哺乳仔豬通過吮吸母乳獲得母源抗體SIgA后，SIgA能夠抑制PEDV在腸道上皮細胞的附著與增殖，保護仔豬腸道上皮細胞，阻止PEDV侵入機體[9]。研究表明，接受母源抗體的仔豬、保育豬糞樣中PEDV的RNA載量明顯減少，母豬乳汁IgA抗體水平高，其所產仔豬糞樣中PEDV的RNA載量相對就低[10]?？讏@園等[11]研究發(fā)現(xiàn)，母豬乳汁中IgA抗體水平高，仔豬發(fā)病率就會降低，反之發(fā)病率會增加。

本研究采用實驗室已經建立的PEDV IgA、IgG抗體間接ELISA方法以及PEDV RT-PCR病原學檢測方法，對免疫母豬群和疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進行相關抗體水平及PEDV測定，探討IgA、IgG抗體水平與PEDV病原之間的相關性，以期為我國豬群豬流行性腹瀉免疫效果評估及程序的制定、優(yōu)化提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品 乳汁采自廣東地區(qū)某豬場疑似仔豬腹瀉母豬群乳汁及免疫過豬流行性腹瀉病毒弱毒活疫苗相關產品的豬群乳汁、血清。

1.2 主要試劑 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit購自金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司；AMV反轉錄酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker 和dNTPs（2.5 mmol/L）購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技 （北京）有限公司；PEDV乳汁IgA、IgG抗體檢測試劑盒為實驗室自建。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 參照GenBank中登陸的PEDV ORF3基因序列，通過Primer Permier 5.0和Oligo 7.0軟件在其保守區(qū)設計引物，引物序列及樣品處理方法參照文獻[12]。

1.3.2 PEDV RT-PCR的擴增 以處理好的樣品cDNA為模板，用所設計的能夠區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的特異性引物對疑似仔豬腹瀉母豬群14份乳汁進行常規(guī)的PEDV RT-PCR檢測，確定乳汁中PEDV的感染情況。擴增體系20 uL：其中2×Max 10 μL、上下游引物（20 μmol/mL）各 0.4 μL、cDNA 0.4 μL、 補充去離子水至終體積為 20 μL。PCR反應條件：98℃預變性 2 min，98℃變性 10 s；58℃退火5 s，72℃延伸5 s，30個循環(huán)。反應結束后，擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測方法的建立采用純化的PEDV抗原包被ELISA微量反應板，按照常規(guī)間接ELISA操作方法[13-14]，建立PEDV IgA、IgG抗體ELISA檢測方法。采用PEDV抗體ELISA檢測方法對上述送檢的疑似仔豬腹瀉豬場14份乳汁進行IgA抗體水平測定，并對免疫豬群乳汁對應的血清樣品進行IgA、IgG抗體水平測定，確定乳汁中PEDV IgA抗體與血清中IgA、IgG抗體水平及其相關性。

2 結果與分析

2.1 PEDV RT-PCR擴增 采用特異性檢測引物對疑似仔豬腹瀉豬群的14份乳汁進行常規(guī)PEDV RT-PCR檢測，確定14份乳汁中有6份為PEDV陽性 （確定7號樣品為PEDV疫苗株，其片段大小為278 bp，其余5份均為PEDV野毒感染，其片段大小為327 bp），且腹瀉豬只中PEDV野毒陽性率為100%（見表 1、圖 1）。

表1 樣品中PEDV抗原檢測結果

2.2 乳汁IgA抗體水平的測定 采用實驗室已經建立的PEDV IgA抗體檢測方法對送檢的14份乳汁樣品進行IgA抗體水平檢測。結果發(fā)現(xiàn)，14份乳汁中有4份IgA抗體呈現(xiàn)陰性，其中標記為腹瀉豬只的IgA抗體陰性率占100%。且在陽性樣品中，當乳汁中IgA抗體水平接近臨界值（0.3）時，乳汁中PEDV基本呈現(xiàn)陽性（見表2）。

圖1 乳汁樣品中PEDV RT-PCR檢測結果

表2 乳汁IgA抗體水平測定

2.3 PEDV IgA、IgG抗體水平的測定 采用實驗室自建的PEDV IgA、IgG抗體檢測方法對送檢免疫健康豬群乳汁及其相對應的血清樣品進行IgA、IgG抗體水平檢測，結果發(fā)現(xiàn)，免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA、IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關（見圖2-圖4），同時對乳汁和血清中IgA抗體水平進行測定，發(fā)現(xiàn)血清中IgA抗體遠遠低于乳汁中的抗體水平（見圖 3）。

圖2 乳汁中IgA、IgG抗體水平測定圖

3 討 論

研究表明，種豬胎盤屏障結構決定了母源抗體不能直接通過胎盤直接傳遞給仔豬，因此，仔豬獲得母源抗體的主要途徑是通過初乳的攝入。初乳中富含IgG抗體，仔豬攝入后迅速進入血液循環(huán)形成保護性抗體，攝入的IgA抗體可以在腸道局部黏膜建立黏膜免疫，共同抵御外界病原微生物的入侵[15]。對疑似發(fā)生仔豬腹瀉母豬群乳汁進行PEDV病原學檢測及IgA抗體檢測發(fā)現(xiàn)，所有腹瀉仔豬對應的母豬乳汁中PEDV抗原均呈現(xiàn)陽性，而腹瀉仔豬所吮乳汁中IgA抗體呈陰性，且乳汁中IgA抗體水平趨于臨界值的情況下，乳汁中PEDV亦呈現(xiàn)陽性。說明乳汁中IgA抗體水平可以反映出哺乳仔豬的黏膜免疫情況[16]。此外，乳汁中的IgA抗體只有達到一定的水平才能對仔豬腸道黏膜具有保護作用，低水平的IgA抗體很容易受到PEDV的攻擊。通過檢測乳汁中IgA抗體水平的高低，可以直接對疫苗免疫效力進行評價，進而分析仔豬的免疫保護力情況，及時做好PED的免疫防控工作。

圖3 血清與乳汁中IgA抗體水平測定圖

圖4 血清中IgA、IgG抗體水平測定圖

對免疫豬群乳汁IgA抗體及其對應的血清IgA、IgG抗體進行相關檢測，結果發(fā)現(xiàn)：免疫豬乳汁中IgA抗體水平與血清中IgA和IgG水平呈現(xiàn)很好的正相關性，這與先前報道的結果一致[17]。研究表明，母豬口服感染PEDV的腸道內容物，利用熒光中和試驗測定母豬和哺乳仔豬的血清、母豬初乳和乳汁中中和抗體滴度，結果發(fā)現(xiàn)在PEDV感染后3周內母豬血清樣品中可檢測到中和抗體，且乳汁中和抗體滴度至少與母豬血清樣品中一樣，而初乳樣品中的抗體滴度均高于血清和血清樣品。表明初乳和乳汁是仔豬中和抗體的來源[18]。對免疫豬群乳汁和血清中IgA、IgG抗體進行相關檢測，結果提示，通過血清中IgG的抗體水平能夠間接反映出母豬乳汁中IgA的抗體水平情況，解決了早期因乳汁黏度過大、難以采集的問題，大大提高了樣品采集的效率，降低了豬只的應激反應，及時、有效地為我國豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及優(yōu)化提供一定的參考依據。此外，乳汁中的IgA抗體水平遠遠高于血清中的IgA，再次佐證PEDV黏膜免疫機理：PEDV到達PP結后，致敏的B細胞可歸巢至乳腺，在乳腺局部分泌二聚體IgA，以SIgA形式存在于乳汁中。單體IgA可以進入血液循環(huán)，SIgA難以進入血液，而是錨定在黏膜表面形成保護層，抵御病原侵入。

由豬流行性腹瀉病毒引起的豬流行性腹瀉在全國范圍內暴發(fā)，且該病在臨床中具有一定的隱蔽性，因此，探尋一個有效的免疫評估標準至關重要。為進一步探討乳汁中IgA抗體水平與PEDV易感程度的相關性，本研究對健康場豬群乳汁IgA抗體水平及PEDV抗原進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，乳汁IgA抗體陽性值接近臨界值時，PEDV抗原檢測為陰性，而在發(fā)病場豬群乳汁中則可以檢測到PEDV抗原。該結果進一步驗證了在存在PEDV感染的條件下，高水平的IgA抗體能夠有效地抵御PEDV入侵。母源SIgA的水平與仔豬對PEDV感染的抵抗力有關，而血液中的中和抗體與其對仔豬的保護作用沒有相關性[19-20]。因此，如何有效地刺激動物機體產生特異性的高水平IgA抗體，是防控豬流行性腹瀉的關鍵。

4 結論

乳汁IgA抗體是有效保護低日齡仔豬早期免于PEDV感染的關鍵性抗體，其抗體水平較低的情況下，極易受到PEDV入侵，該抗體水平變化與疫病的進程和機體的抗病毒能力具有一定的相關性。此外，通過血清中IgG抗體水平的檢測能夠間接反映出疫苗的免疫保護水平，有效解決了初乳難以采集的問題，能夠及時有效地為我國豬群豬流行性腹瀉免疫程序的制定及其優(yōu)化提供一定的參考依據。