王瑞 吳淑貞 李楊 陳娟

廣東省佛山市婦幼保健院產(chǎn)科（廣東佛山528000）

胚胎發(fā)育，胚胎植入和胎盤發(fā)育是哺乳動物成功懷孕的先決條件。滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤絨毛的特化細(xì)胞，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用［1］。胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞穿入部分宮壁肌層，可導(dǎo)致胎盤植入，該疾病是產(chǎn)科的嚴(yán)重并發(fā)癥。滋養(yǎng)細(xì)胞是上皮細(xì)胞系的胎盤細(xì)胞，特別在胎盤植入的孕婦中其滋養(yǎng)細(xì)胞具有高度增殖和侵襲性［2］，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲性是導(dǎo)致胎盤植入的重要病因之一，找到調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲性的機(jī)制是預(yù)防和治療胎盤植入的重要方向［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是一類長度超過 200 nt的核苷酸轉(zhuǎn)錄物［4］。研究［5］表明，多種LncRNAs參與了調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能，且研究表明多種LncRNAs可以在孕婦的胚泡和蛻膜中差異表達(dá)，并且其能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和侵襲［6］。既往有研究［7］表明，LncRNA-TCL6在先兆流產(chǎn)妊娠的胎盤組織中高表達(dá)，但LncRNA-TCL6對于胎盤植入的影響仍未明確。本研究旨在探討LncRNA-TCL6在胎盤植入組織中的表達(dá)水平及對滋養(yǎng)層細(xì)胞活性和遷移的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象選取本院2017年6月至2018年12月于我院行剖宮產(chǎn)的患者共80例，其中符合胎盤植入診斷的40例（植入組），所有患者符合《胎盤植入診治指南（2015）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)：分娩前依靠臨床高危因素結(jié)合彩色多普勒超聲或MRI征象評估，最終確診需要根據(jù)手術(shù)中或分娩時(shí)所見或分娩后的病理學(xué)診斷。選擇正常胎盤40例（正常組），取胎盤與母體子宮相鄰的胎盤組織，用無菌PSB洗滌所有收集的組織，然后立即快速冷凍液氮，儲存在-80℃待測。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核通過，所有產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和處理HTR-8/Svneo人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下于37℃在5%CO2培養(yǎng)箱中生長，培養(yǎng)基采用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，采用100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素（Gibco，Grand Island，NY，USA）預(yù)防細(xì)菌污染。

1.3RNA提取和RT-PCR用Trizol試劑（Invitrogen）從中胎盤組織或細(xì)胞中分離總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Bio，Japan）對所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將1 mg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa Bio）用于測定胎盤或細(xì)胞中SPRY4-IT1表達(dá)水平，具體的引物為 LncRNA-TCL6：F：TGTCTCATTCGCCTCTGGAT，R：GTCTCCCTCCTTCTGCCTTT；采用GAPDH作為內(nèi)參對照，GAPDH：F：CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC，R：ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC。用ABI 7500進(jìn)行qRT-PCR測定（Invitrogen）。分析結(jié)果并相對于閾值循環(huán)（CT）值表達(dá)，通過2-ΔΔCt法計(jì)算 LncRNA-TCL6 在胎盤組織中或細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將HTR-8/Svneo細(xì)胞在6孔板鋪板后，采用Lipofectamine2000（Invitrogen）嚴(yán)格按照說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用陰性對照（NC）：UUUGUAUUCUGAAUCGGAUGA，si-LncRNA-TCL6-1：UGGAUUUGUACCAUUCUUCUG，si-LncRNA-TCL6-2：ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG，和 si-LncRNA-TCL6-3：UCAUAUUCUGAAUCUCAUCCU，轉(zhuǎn)染HTR-8/Svneo細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6 h，更換培養(yǎng)基并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞活性檢測取對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo細(xì)胞，以5×103個/孔接種于96孔板，每組設(shè)5個復(fù)孔，檢測敲低LncRNA-TCL6表達(dá)與否對HTR-8/Svneo細(xì)胞的活性情況，細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)8、24、48、72、96 h后加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后恒溫低速振蕩10 min，然后用多功能酶標(biāo)儀（測量波長450 nm）檢測各處理組吸光度（OD）值。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)劃痕實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種在六孔板中，轉(zhuǎn)染并生長至80%～90%匯合。通過用移液管尖端刮擦板來產(chǎn)生傷口，并用PBS除去碎片。獲得圖像以評估細(xì)胞在指定時(shí)間點(diǎn)遷移到傷口區(qū)域的能力，每個實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：6×104經(jīng)轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細(xì)胞將懸浮于含有1%FBS的RPMI 1640中，并加入 Transwell小室上室（孔徑為8 μm；EMD，Millipore，Billerica，MA，USA）。 在下室中，加入700 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2下孵育24 h后，細(xì)胞侵入Transwell小室下層，用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)，并通過Olympus IX71倒置顯微鏡成像，每個小室取5個視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取其平均值，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western-Blot檢測采用RIPA細(xì)胞裂解液（Beyotime，中國上海）提取HTR-8/Svneo細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，采用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，并采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上（Millipore），經(jīng)5%脫脂牛奶1封閉小時(shí)后，采用相應(yīng)的一抗孵育4℃過夜。E-Cadherin 兔單抗（1∶1 000，No.3195），N-Cadherin兔單抗（1∶1 000，No.13116），Vimentin（1∶1 000，No.5741），GAPDH（1∶2 000，No.5174），抗體均夠自Cell Signaling Technology（CST）公司。用TBST洗膜三次后，將膜培養(yǎng)用相應(yīng)的二抗（Beyotime，中國上海）在室溫下孵育1 h后，采用ECL發(fā)光法進(jìn)行顯影。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad prism 7.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胎盤植入患者胎盤組織的LncRNA-TCL6表達(dá)水平植入組的胎盤的LncRNA-TCL6的相對表達(dá)量為（3.42±0.41）倍數(shù)變化，顯著高于正常組（P ＜0.05），見圖1。

2.2敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細(xì)胞活性的影響采用不同的siRNA轉(zhuǎn)染敲減HTR-8/Svneo細(xì)胞LncRNA-TCL6表達(dá)水平后，不同組HTR-8/SVneo的LncRNA-TCL6表達(dá)水平見圖2A，3組經(jīng)轉(zhuǎn)染SiRNA的LncRNA-TCL6表達(dá)水平均顯著低于NC組（P＜0.05），si-LncRNA-TCL6-2的敲減效率最高。對HTR-8/Svneo細(xì)胞敲減LncRNA-TCL6表達(dá)水平后，其8、24、48、72、96 h的細(xì)胞活性顯著低于NC組（P ＜0.05），見圖2B。

圖1 正常組和植入組的LncRNA-TCL6表達(dá)水平對比Fig.1 Comparison of LncRNA-TCL6 expression levels between normal and implanted groups

2.3 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移能力的影響對HTR-8/SVneo細(xì)胞的LncRNATCL6敲減后，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲減組24、48 h的細(xì)胞遷移率均顯著低于NC組（P＜0.05）；且Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲減組其24 h的細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于NC組（P＜0.05），見圖3。

圖2 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細(xì)胞活性的影響Fig.2 Knockdown of the effect of LncRNA-TCL6 on HTR-8/SVneo cell activity

圖3 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 The effect of LncRNA-TCL6 on the migration of HTR-8/SVneo cells

2.4 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)si-LncRNA-TCL6的HTR-8/Svneo細(xì)胞其E-Cadherin表水平顯著上升，而Vimentin、N-Cadherin的表達(dá)水平顯著下降，見圖4。

圖4 敲減LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of knockdown of LncRNA-TCL6 on HTR-8/Svneo protein expression

3 討論

研究［9］表明，只有不到2%的人類基因組可以轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)編碼基因。其他轉(zhuǎn)錄本，包括眾所周知的microRNA，還包括LncRNAs均不轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。研究［10］顯示LncRNA已經(jīng)成為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與了多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展。有研究報(bào)道了先兆子癇中LncRNA的表達(dá)譜與胎盤病理學(xué)之間存在關(guān)聯(lián)［11］。在既往研究［12］中報(bào)道了PE中的LncRNA-TCL6在先兆流產(chǎn)中的胎盤組織中存在異常表達(dá)，但其具體與胎盤植入的關(guān)系仍缺乏相關(guān)研究。在本研究中，筆者進(jìn)一步驗(yàn)證了胎盤植入患者胎盤組織中LncRNATCL6的表達(dá)水平顯著升高，且敲低LncRNA-TCL6的表達(dá)抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力，也初步表明了LncRNA-TCL6對HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移能力的調(diào)控是通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白參與的，為LncRNA-TCL6在胎盤植入的調(diào)控機(jī)制中提供了理論基礎(chǔ)。

本研究首先探討了LncRNA-TCL6在胎盤植入患者中胎盤組織的表達(dá)情況，表明了LncRNATCL6在胎盤組織中存在高表達(dá)。同時(shí)既往有研究［13］探討了循環(huán)胎盤相關(guān)的LncRNA作為先兆流產(chǎn)的潛在生物標(biāo)志物，鑒定了胎盤中存在多種LncRNA差異表達(dá)。關(guān)于LncRNA調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖的研究中，既往研究表明了內(nèi)源性的LncRNAATB的抑制可降低了HTR-8/Svneo細(xì)胞的增殖和管形成［14］。而也有研究表明LncRNA-TUG1能在PE患者的胎盤樣本中顯著減少，敲低TUG1能影響滋養(yǎng)層細(xì)胞體外細(xì)胞增殖，凋亡，遷移和網(wǎng)絡(luò)形成［15］。因此，本研究明確了胎盤組織中的LncRNATCL6是促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和促進(jìn)胎盤植入的重要LncRNA，但對于LncRNA-TCL6是否在循環(huán)中能檢測到仍需要進(jìn)一步評估。

EMT過程通常與許多人類疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，由于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生EMT程序在胎盤植入中具有重要意義。既往研究［16］提出胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞從附著的表型轉(zhuǎn)變?yōu)檫w移表型，這種遷移表型在類似于其他發(fā)育EMT的過程中侵入母體蛻膜和螺旋動脈，這可能是導(dǎo)致胎盤植入發(fā)生的重要機(jī)制，但目前對于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞通過EMT侵入母體蛻膜和動脈的機(jī)制仍未明確。本研究結(jié)果明確了LncRNA-TCL6參與了滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞遷移和侵襲。在HTR-8/Svneo滋養(yǎng)層細(xì)胞敲減LncRNA-TCL6的表達(dá)水平后，細(xì)胞的活性顯著下降，而細(xì)胞的遷移能力也顯著下降。而細(xì)胞發(fā)生EMT遷移中，其EMT相關(guān)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白會先發(fā)生變化，因此本研究中也進(jìn)一步分析了敲低LncRNA-TCL6表達(dá)后，檢測HTR-8/Svneo細(xì)胞發(fā)生EMT的相關(guān)蛋白如E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin的表達(dá)水平的變化，結(jié)果也顯示了干預(yù)后其E-Cadherin表水平顯著上升，而Vimentin、N-Cadherin的表達(dá)水平顯著下降，因此，LncRNATCL6通過了調(diào)控EMT的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平參從而抑制了滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移能力。既往有研究［17］顯示LncRNA-TCL6可通過調(diào)節(jié)EGFR途徑抑制細(xì)胞的增殖，鑒于EGFR通路在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和分化以及胚胎著床中的重要作用，同時(shí)EGFR途徑也能影響細(xì)胞發(fā)生EMT，因此懷疑LncRNA-TCL6可能通過調(diào)控了EGFR途徑影響胚胎植入。但進(jìn)一步具體的LncRNA-TCL6調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究。

綜合上述，本研究結(jié)果初步表明LncRNATCL6在胎盤植入組織中表達(dá)顯著升高，且LncRNA-TCL6參與滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移作用，因此LncRNA-TCL6有望成為治療胎盤植入的重要靶點(diǎn)。